우리는 호중구 세포 외 트랩(neutrophil extracellular traps, NET)의 정량화를 위한 실시간 현미경 방법을 개발했습니다. 이러한 NET은 선천성 면역 방어에 중요한 역할을 합니다. 그러나 조직에 NET이 축적되는 것이 여러 염증성 질환 및 자가면역 질환의 병태생리학에 기여한다는 것이 분명해졌습니다.
NET의 병리학적 함의로 인해 NETosis 길항제 개발에 대한 관심이 높아졌습니다. NETosis 억제를 연구하기 위해 인간 NET 방출의 정량화를 위한 실시간 현미경 방법을 개발하여 NETosis와 그 억제를 고처리량 방식으로 연구할 수 있었습니다. 호중구는 민감한 세포이며 기계적, 미생물 및 기타 유형의 스트레스로 인해 정화 과정에서 자극에 대한 반응성을 변경할 수 있습니다.
따라서 호중구 활성화를 최소화하기 위해 호중구 분리 프로토콜을 검증하는 것이 중요합니다. 따라서 이 기술은 건강한 개인과 질병에 걸린 개인으로부터 NET 방출을 연구할 수 있습니다. 또한 다양한 생리적 자극에 의해 유도되는 NET 형성의 동역학을 연구할 수 있습니다.
이 고처리량 현미경 기술을 통해 시트룰린 히스톤 2A 및 4를 표적으로 하는 단클론 항체인 NETosis 길항제 CIT-013이 IC 50 또는 4.6 나노몰로 NET 방출을 효율적으로 억제할 수 있음을 입증할 수 있었습니다. 이는 이 분석법이 NETosis 길항제를 테스트하는 데 적합하다는 것을 보여줍니다. 리튬 헤파린 튜브에서 건강한 지원자의 말초 혈액을 채취한 후 혈액을 새로운 50ml 튜브로 옮깁니다.
리튬 헤파린 튜브를 DPBS로 헹구고 동일한 50ml 튜브로 옮겨 혈액 대 DPBS 비율이 1:1이 되도록 합니다. 혼합 후 밀도 구배 용액 위에 희석된 혈액을 추가합니다. 400G에서 40분 동안 최소한의 가속과 휴식으로 혈액을 원심분리하십시오.
10 밀리리터 피펫으로 상단 플라즈마 층을 버리십시오. 그런 다음 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 말초 혈액 단핵 세포와 밀도 구배 용액을 버립니다. 적혈구와 호중구가 포함된 층을 부드럽게 흔든 후 15ml의 DPBS에 다시 현탁시킵니다.
25ml의 6% 덱스트란 용액과 0.9% 염화나트륨 용액을 넣고 튜브를 뒤집어 섞습니다. 25분 배양 후 10ml 피펫을 사용하여 상단 호중구층을 새 50ml 튜브로 옮기고 500G에서 10분 동안 원심분리합니다. 튜브를 디캔팅하여 상등액을 버리고 펠릿을 10ml의 염화암모늄 칼륨 용해 완충액에 다시 현탁시킵니다.
동일한 용해 완충액 40ml를 추가하고 실온에서 배양하면서 용액이 반투명해질 때까지 튜브를 계속 뒤집습니다. 튜브를 350G에서 10분 동안 원심분리합니다. 상등액을 제거한 후에, 천천히 그리고 dropwise, 현탁액으로 호중구를 가져오지 않고 호중구 펠릿의 정상에 10%on 5 밀리리터의 배양 매체를 추가하십시오.
호중구 펠릿 위에 존재하는 대부분의 적혈구가 배양 배지에 다시 부유할 때까지 튜브를 부드럽게 소용돌이칩니다. 상등액을 제거한 후, 호중구 펠릿을 10 밀리리터의 배양 배지에 다시 현탁시키고, 10 %를 완전히 현탁시키면, 최대 50 밀리리터의 배양 배지 10 %를 첨가하고 10 밀리리터의 호중구 세포 외 트랩 또는 NET 분석 버퍼에서 펠렛을 다시 현탁시키기 전에 혼합물을 원심 분리한다. 먼저 96웰 플레이트의 각 웰에 0.001%폴리-L-라이신 용액을 추가하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.
200마이크로리터의 DPBS로 우물을 세 번 씻고 우물을 자연 건조시킵니다. 다음으로, Neutrophil Extracellular Trap 또는 NET assay buffer에서 필요한 수의 호중구를 다시 현탁합니다. NET 분석 버퍼의 4배 농축된 DNA 염료를 각 웰로 전달합니다.
NET 분석 버퍼에서 4배 농축된 NETosis 자극을 해당 웰에 추가합니다. 그런 다음 NET 분석 완충액 및 호중구 현탁액에 4배 농축된 NETosis 길항제를 해당 웰에 추가합니다. 플레이트를 100G에서 2분 동안 원심분리합니다.
그런 다음 인큐베이터에 배치된 라이브 셀 현미경 분석 시스템에 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 삽입합니다. 호중구 현탁액이 포함된 96웰 이미징 플레이트를 라이브 셀 현미경 분석 시스템에 배치한 후 시스템 소프트웨어를 엽니다. schedule을 클릭하여 획득하고 더하기 버튼을 클릭하여 실행합니다.
그런 다음 일정에 따라 스캔을 선택하고 다음을 클릭합니다. 새 선박을 처음부터 만들려면 선박 생성 섹션에서 새로 만들기를 선택하고 다음을 클릭합니다. Scan Type(스캔 유형) 섹션에서 Standard(표준)를 선택하고 Next(다음)를 클릭합니다.
스캔 설정을 셀별, 없음으로 선택합니다. 이미지 채널, 위상 대비는 녹색입니다. 획득 시간, 100밀리초 및 목표 20배.
그런 다음 다음을 클릭합니다. Vessel Selection(선박 선택) 섹션에서 스캔할 적절한 선박 유형을 선택하고 Next(다음)를 클릭합니다. 서랍에서 선박의 위치를 지정하고 다음을 클릭합니다.
Scan Pattern(스캔 패턴) 섹션에서 스캔해야 하는 웰과 웰당 이미지 수를 선택합니다. 다음을 클릭합니다. Vessel Notebook 섹션에서 선박에 대한 정보를 제공합니다.
플레이트 이름을 입력하고 다음을 클릭합니다. Analysis Setup(분석 설정) 섹션에서 defer analysis until later(나중까지 분석 연기)를 선택하고 Next(다음)를 클릭합니다. Scan Schedule(스캔 일정) 섹션에서 Create new schedule(일정 간격으로 검사를 사용하여 새 일정 만들기)을 선택하고 Add Scans to Schedule(일정에 검사 추가) 섹션에서 1시간을 선택합니다.
첫 번째 스캔 후 5시간 후에 스캔 중지를 선택합니다.다음을 클릭하고 추가를 클릭하여 스캔 정보가 올바르면 예약합니다. 호중구의 위상차 및 면역형광 이미지를 획득한 후 라이브 셀 현미경 분석 소프트웨어를 실행합니다.
보기에서 분석할 살아있는 세포 현미경 검사 실험을 선택합니다. Create New Analysis Definition(새 분석 정의 생성)을 선택하고 Next(다음)를 클릭합니다. 그런 다음 Analysis Type(분석 유형) 섹션에서 기본 분석기를 선택하고 Next(다음)를 클릭합니다.
이미지 채널 섹션에서 녹색을 선택하고 단계를 선택 취소한 후 다음을 클릭합니다. 이미지 레이어 창을 열고 녹색을 선택한 다음 phase를 선택 취소합니다. 녹색 섹션에서 자동 크기 조정을 끄고 최소값 및 최대값을 수동으로 설정합니다.
그런 다음 vessel scan times 창을 열고 NET이 있는 positive control well을 나타내는 이미지를 선택합니다. 해석 정의 설정 창을 열고 개체 이름에 대한 NET을 작성합니다. 세분화의 경우 Adaptive를 선택합니다.
임계값 GCU의 경우 3에서 5 사이를 선택하고 가장자리 분할 켜기를 빼기 10과 0 사이로 설정합니다. 그런 다음 정리를 위해 구멍 채우기를 100제곱마이크로미터로 선택하고 크기를 마이너스 1픽셀로 조정합니다. 필터에서 200제곱마이크로미터보다 큰 영역, 24.6보다 작은 평균 강도, 7, 000보다 큰 통합 강도를 선택합니다.
그런 다음 현재 미리보기 또는 모두 미리보기를 클릭하여 설정을 적용합니다. 다양한 NET 구조 위로 마우스를 가져가 분석 설정을 조정하여 거짓 긍정 및 거짓 부정 NET을 미세 조정합니다. NET 분석에 대한 설정이 올바르면 다음을 클릭합니다.
Scan times and well 섹션에서 분석할 시점과 웰을 선택하고 Next(다음)를 클릭합니다. Save and Apply Analysis Definition 섹션에 정의 이름을 삽입하고 Next를 클릭합니다. 분석 정보가 확인되고 정확해지면 Finish(마침)를 클릭합니다.
관심 있는 용기 내의 분석을 클릭하여 실험 분석을 엽니다. 그런 다음 그래프 측정항목 창을 엽니다. 그런 다음 더하기 버튼을 클릭하여 메트릭을 만듭니다.
데이터를 NET 농도 백분율로 표시할 때 메트릭 섹션에서 영역을 선택하고 값 섹션에서 Confluence를 선택합니다. NETting 호중구의 백분율로 데이터를 표시할 때 Metric 섹션에서 Object Count를 선택하고 Value 섹션에서 Per image를 선택합니다. 메트릭 설정을 구성한 후 사용자 정의 메트릭 섹션에서 NETs Area Confluence 또는 NETs Object Count Per Image를 선택합니다.
Select Scans(스캔 선택) 및 Select Well(웰 선택) 섹션에서 각각 분석에 필요한 모든 시점과 웰을 선택합니다. 마지막으로 데이터 내보내기를 클릭합니다. 칼슘 이온단 자극은 PMA에 비해 더 빠른 NETosis를 유도하여 NET을 방출하는 호중구의 비율이 더 높았습니다.
칼슘 이온단에 의해 유도된 NET은 호중구 원형질막 너머로 더 확산된 반면, PMA에 의해 유도된 NET은 호중구 원형질막에 더 가깝게 유지되었습니다. 호중구가 코팅된 면역 복합체, FMLP 및 요산나트륨 결정으로 활성화될 때 NET 수치가 높아지는 추세가 관찰되었습니다. 23187에 대한 반응으로 NET 방출은 4.6 나노몰의 절반 최대 억제 농도에서 CIT-013에 의해 완전히 억제되었습니다.
