Поэтому основным направлением наших исследований является изучение мезенхимальных стромальных клеток, внеклеточных везикул для регенерации тканей. Проблема и цель нашего исследования заключается в том, чтобы перевести бесклеточный подход в клиническое применение наряду с клеточной терапией. Определение характеристик имеет решающее значение, и на сегодняшний день получить чистый везикул для глубокой характеризации очень сложно, потому что не существует протоколов для достижения высокой чистоты.
Поэтому мы хотели внедрить технологию сортировщика клеток для изучения, характеристики и, в конечном итоге, внедрения в клиническую практику этого нового подхода, основанного на внеклеточных везикулах. Остановимся на сортировочной части. Как вы увидите, некоторые команды будут выполняться в программном обеспечении сортировщика, а другие — на сенсорном экране.
Наш протокол имеет значительные преимущества по сравнению с другими методами сепарации электромобилей. Во-первых, использование сопла 70 микро при давлении 35 фунтов на квадратный дюйм сохраняет целостность последующей сортировки EV. Затем можно изолировать определенную популяцию электромобилей и, наконец, инструмент позволяет сохранить настройку сортировки, чтобы сделать процесс воспроизводимым.
В нашей лаборатории мы работаем над созданием новой многоцветной панели для анализа внеклеточных везикул. В частности, мы сосредоточились на настройке приборов и на изучении флуорохромов. Мы считаем, что возможность идентифицировать и выделить редкую популяцию везикул может обеспечить хорошее улучшение их характеристик, а также изучение их роли в биологических процессах.
Для начала откройте напорную линию и вакуумную систему сортировщика ячеек. Включите прибор, откройте шкаф биобезопасности и запустите программное обеспечение сортировщика. Нагнетайте давление в жидкостной и газовой системе, а затем включите жидкостную систему.
Активируйте каплевидный привод пьезоэлектрического кристалла в сопле, который вибрирует для генерации капель. Выполните процедуру удаления пузырьков, чтобы устранить пузырьки в системе. Затем запустите пятимиллилитровую трубку с чистящим раствором в течение пяти минут при высоком перепаде давления, а затем пятимиллилитровую трубку с деионизированной водой в течение пяти минут.
Чтобы выполнить процедуру ручного запуска, перейдите на вкладку управления лазером и включите питание лазера. Изучите вертикальное выравнивание потока. Для определения лазерного пятна нажмите вкладку «Перехват лазерного потока».
Нажмите кнопку с зеленой стрелкой и следуйте инструкциям на сенсорном мониторе. Инициализируйте IntelliSort и установите частоту падения диска вместе со значением амплитуды по умолчанию, при котором поток образует каплю. Для процедуры точного лазерного выравнивания загрузите пятимиллилитровую трубку с шариками выравнивания QC в пробоотборник и запустите ее в протоколе QC.
На вкладке точного выравнивания выберите нужные параметры по осям X и Y, чтобы визуализировать хорошо уплотненные и собранные бусины. После проверки ручного выравнивания выполните автоматический контроль качества с диаметром валиков контроля качества с точностью до трех микрометров. Сохраните данные контроля качества в программном протоколе выравнивания.
Чтобы завершить работу с IntelliSort, расположите отклоняющие пластины в правильном положении в сортировщике и включите напряжение примерно до 3 000 вольт. Выберите выход сортировки с шеститрубочным держателем. Выберите потоки на индикаторе потока, чтобы включить их и выполнить тестовый поток.
Включите кнопку автоматического определения задержки отбрасывания IntelliSort, чтобы задать правильную задержку отбрасывания и повторно проверить потоки. Затем активируйте режим поддержания IntelliSort и проверьте задержку отбрасывания вручную. Загрузите ручной протокол задержки падения в программное обеспечение сортировщика и получите флуоресцентные контрольные валики.
После установки правильного держателя слайда выберите сортировку, а затем мастер задержки перетаскивания и логику сортировки. Проверьте с помощью флуоресцентного микроскопа, что 97% флуоресцентных шариков присутствуют на пятой луже. Для начала настройте сортировщик ячеек и активируйте IntelliSort.
После выполнения калибровки рассеяния выполните шаги по сбору образцов для каждого образца. Чтобы создать новый протокол для сортировки образцов, выберите файл, а затем протокол и новый на панели инструментов. Нажмите кнопку Настройка сбора данных в программном обеспечении сортировщика.
В окне параметра сбора выберите интересующие каналы и отключите остальные. Затем поместите в пробоотборник пятимиллилитровую пробирку с образцом. На сенсорном экране нажмите кнопку загрузки.
На панели инструментов программного обеспечения сортировщика выберите «Сбор» и нажмите кнопку «Пуск». Когда появится окно свойств образца, вставьте имя образца и нажмите кнопку ОК. Для создания стратегии стробирования выберите гистограмму, а затем создайте гистограмму.
Создайте три точечные диаграммы, первая из которых содержит 488-FSC1-Height log по оси X и 488-SSC-Height log по оси Y. Второй с 488-FSC-2 Height log по оси X и 488-SSC-Height log по оси Y, а третий с 488 513 X 26 CFSE Height log по оси X и 488-SSC Height log по оси Y. Нажмите кнопку «Захват», а затем «Пуск» и вставьте имя образца.
Во время сбора данных нарисуйте область, определяющую негативные события CFSE, и область, определяющую положительные события CFSE. Затем на вкладке сортировки определите регион, который нужно отсортировать. Когда скорость потока стабилизируется, выберите сбор данных с последующей остановкой.
Начните сортировку, выбрав сортировку на панели инструментов программного обеспечения сортировщика. Чтобы сохранить настройки сортировки, выберите сортировку на панели инструментов, а затем нажмите кнопку Сохранить настройки сортировки. Чтобы проверить чистоту отсортированного населения, сначала приобретите пятимиллилитровую трубку с чистящим раствором на 10 минут при высоком перепаде давления, а затем пятимиллилитровую трубку с деионизированной водой на 10 минут.
Получите 0,22-микрометровый отфильтрованный PBS и убедитесь, что нет положительных событий CFSE. Затем разведите пять микролитров отсортированной пробы в 100 микролитрах 0,22-микрометра, отфильтруйте PBS. Получить отсортированные образцы и записать объемы Экспрессия CD9, CD63, CD81 и CD44 во внеклеточных везикулах, полученных из жировой ткани, не изменилась после сортировки CFSE.
Анализ отслеживания наночастиц показал, что распределение везикул по размерам оставалось неизменным до и после сортировки. Анализ с помощью просвечивающей электронной микроскопии показал, что морфология везикул не претерпела существенных изменений в процессе сортировки. Кроме того, лечение составило 0,1%: Triton X-100 снижает количество положительных везикул CFSE, подтверждающих их везикулярное происхождение.
