Мы демонстрируем новый метод визуализации с возможностью безметочной съемки, высокой химической специфичностью и субклеточным разрешением. Наша методология может ответить на вопросы о метаболической дисфункции при старении и таких заболеваниях, как рак Рамановская визуализация, в сочетании с двухфотонной флуоресценцией и генерацией второй гармоники, предлагает неразрушающую и безметочную технологию визуализации, которая требует минимальной подготовки образца и достигает высокого субклеточного разрешения без повреждения образца клетки. В рамках нашей платформы используется несколько методов визуализации.
Люди должны следовать нашему протоколу в меру своих возможностей, принимая во внимание, что наша система создана собственными силами. Попутно они должны выработать свою собственную практику, чтобы обеспечить успех. В двух отдельных пробирках начните с измерения и смешивания 10 миллиграммов порошка DMEM с 4,7 миллилитрами двойной дистиллированной воды в конической пробирке объемом 15 мл.
Тщательно перемешайте и переверните трубку, чтобы раствор хорошо перемешался. Для обеих пробирок добавьте 4,7 мл оксида дейтерия, 0,5 мл FBS и 0,1 мл пенициллина и стрептомицина перед вихревым и переворачивающим пробирку. Затем добавьте избыток фенилаланина в одну пробирку и излишки порошка триптофана во вторую пробирку и снова перемешайте.
Добавьте метионин и треонин в дозе 30 и 95 мг на мл соответственно в обе пробирки с последующим вихревым и переворачивающим пробирку. После этого отфильтруйте подготовленную среду с помощью 25-миллиметрового шприцевого фильтра с 0,22-микрометровыми фильтрами. Запечатайте все носители, содержащиеся в конических трубках, с помощью Parafilm.
Храните подготовленную среду при температуре четыре градуса по Цельсию. Поддерживайте клетки целителя в колбе с использованием стандартного ДМЕМ с добавлением 10% FBS, 1% пенициллина и стрептомицина. Субкультивируйте целительские клетки в соотношении 1 к 10 до достижения жизнеспособности клеток 80% или выше.
Перед посевом клеток стерилизованные круглые покровные накладки диаметром 12 мм с покрытием из поли-D-лизина погружают в 70% этанол. Высушите накладные листы, используя безворсовые салфетки, и поместите чистые листы крышки в соответствующие углубления пластины. Промойте клетки один раз PBS без ионов магния и кальция.
Добавьте 0,25% трипсина, чтобы диссоциировать адгезивные клетки из колбы, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение трех минут. Затем добавьте в клетки ДМЕМ с добавлением 10% FBS, 1% пенициллина и стрептомицина. Осторожно пипеткой вверх и вниз.
Соберите клетки центрифугированием при 300 G в течение трех минут при комнатной температуре. Затем повторно суспендируют клетки в DMEM с добавлением 0,5% FBS и 1% пенициллина и стрептомицина. Подсчитывают окрашенные трипановым синим клетки с помощью гемоцитометра под световым микроскопом и засевают при плотности от двух раз по 10 до пятых клеток на лунку 24-луночного планшета.
Равномерно распределите ячейки, слегка встряхнув тарелку. Инкубируют при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Через восемь часов замените старую питательную среду 50%-ным оксидом дейтерия и избытком фенилаланина или 50%-ным оксидом дейтерия и избытком триптофана.
Верните клетки в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа на 36 часов. Теперь подготовьте предметные стекла микроскопа с интервалами для визуализации диаметром девять мм. Поместите 15 микролитров PBS, дополненного ионами кальция и магния, и промойте клетки этим же раствором.
Добавьте 0,5 мл 4%-ного раствора параформальдегида, не содержащего метанола, и оставьте планшет под колпаком биобезопасности на 15 минут. Отсасывайте раствор параформальдегида и промывают его ПБС, дважды дополненным кальцием и магнием, железом. Добавьте в каждую лунку по одному мл PBS, дополненного ионами кальция и магния.
Используйте стерильный пинцет, чтобы осторожно удалить крышки из каждого лунки. Инвертируйте их и поместите стороной, содержащей ячейку, в области визуализации, контактирующие с PBS. Запечатайте внешний слой покровного покрытия с помощью прокладки для визуализации с помощью прозрачного лака для ногтей.
Загрузите биологический образец в держатель образца непосредственно под линзой объектива. Затем щелкните значок камеры в программном обеспечении, чтобы включить видеокамеру, и отрегулируйте плоскость фокусировки, чтобы определить интересующую область с помощью объектива 50X. Переключитесь на объектив с 100-кратным увеличением.
Нажмите на значок остановки, чтобы выключить видеокамеру. Затем выберите решетку 1,800 линий на мм и установите диапазон захвата от 400 до 3,150 сантиметров в обратном порядке. Наконец, установите время сбора данных равным 90 секундам, накопление — трем, а биннинг — четырем, чтобы получить наименьший шум и наиболее точный спектр.
Нажмите «Пуск», чтобы разогреть лазер. Начните с нажатия главного переключателя блока управления IX3CBH в положение On, а затем главного переключателя контроллера сенсорной панели. Затем включите главный выключатель адаптера переменного тока источника питания для LDOBIS6 лазерного пульта, подключенного к основному лазерному сумматору FV31S гребенки.
Также включите адаптер переменного тока LDOBIS6 лазерного дистанционного источника питания, подключенного к вспомогательному лазерному сумматору FV31S combine. После этого нажмите главные переключатели включения фотодиодного детектора СИ и синхронного усилителя. Установите лазерную ИК-подсветку на длину волны 1031 нанм Установите пико-изумрудную систему на перестраиваемую длину волны в диапазоне от 720 до 990 нм.
Установите образец на масло и поместите большую каплю воды на предметное стекло микроскопа, где закреплен образец. Выберите размер сканирования 512 на 512 пикселей. Приобретайте и сохраняйте изображения как Olympus.
Графический файл OIR. Установив сигнал на 862.0, получите фоновое изображение и сохраните его. Установите время задержки на восемь микросекунд на пиксель и размер пикселя на 512 на 512 пикселей.
Установите параметр мощности лазерного затвора на 150 милливатт Для реконструкции 3D-изображения настройте вынужденные потери комбинационного рассеяния света на 2 850 см в обратном направлении. После того, как нужные отдельные клетки идентифицированы, зарегистрируйте лазер для сканирования с верхней фокусной плоскости, чтобы обнаружить верхний и нижний слои этих клеток. Для визуализации пространственного распределения сигналов CD на одиночных клетках использовалось зондированное вынужденное комбинационное рассеяние оксида дейтерия.
В контрольных клетках наблюдались умеренные CD, липидные и белковые полосы. Тем не менее, 15 x v и 15 x трип показали более сильные запреты на липиды и белки CD. Количественный анализ показал, что избыток ароматических аминокислот может повысить синтез липидов на 10-17%, но понизить синтез белка на 10%.Метрический анализ пропитанных ароматических аминокислот клеток показал 50%-ное увеличение флавина, разделенного на флавин плюс НАДН, и 10%-ное увеличение ненасыщенных липидов, разделенных на насыщенные липиды.
Показана проекция объема стимулируемых липидных капель комбинационного рассеяния света в контролируемых клетках целителя и условиях избытка ароматических аминокислот. Количественный анализ 3D липидных капель показал увеличение количества, но уменьшение размера ароматических аминокислот в клетках, обработанных по сравнению с контрольной группой. Параметры визуализации для комбинационного рассеяния света и двухфотонной флуоресцентной визуализации должны быть оптимизированы от одного образца к другому, чтобы обеспечить наилучшее качество изображения.
Люди могут соединить нашу систему со вторым гармоническим поколением, чтобы изучить структуру коллагена, которая проясняет ранние метаболические изменения при старении и заболеваниях, а также понять прогрессирование нейродегенерации или рака. Наша технология является первой в своем роде для визуализации синтеза липидов и белков в биологических системах с высоким субклеточным разрешением. Технология также может быть применена в клинике для неинвазивного выявления заболеваний.
