Apresentamos uma nova técnica de imagem com capacidade livre de marcação, alta especificidade química e resolução subcelular. Nossa metodologia pode responder a uma pergunta sobre disfunção metabólica no envelhecimento e doenças como câncer A imagem Raman, juntamente com fluorescência de dois fótons e segunda geração harmônica, oferece uma tecnologia de imagem não destrutiva e livre de rótulos que requer preparação mínima da amostra e alcança alta resolução subcelular sem danificar a amostra celular. Várias modalidades de imagem são operadas como parte de nossa plataforma.
Os indivíduos devem seguir nosso protocolo da melhor forma possível, observando que nosso sistema é construído em casa. Ao longo do caminho, eles devem desenvolver sua própria prática para garantir o sucesso. Em dois tubos separados, comece medindo e misturando 10 miligramas de pó DMEM com 4,7 mililitros de água bidestilada em um tubo cônico de 15 mL.
Vórtice completamente e inverta o tubo para garantir que a solução esteja bem misturada. Para ambos os tubos, adicionar 4,7 mL de óxido de deutério, 0,5 mL de SFB e 0,1 mL de penicilina e estreptomicina antes de vórtex e inversão do tubo. Em seguida, adicione o excesso de fenilalanina a um tubo e o excesso de triptofano em pó ao segundo tubo e misture novamente.
Adicionar metionina e treonina a 30 e 95 mg por mL, respectivamente, a ambos os tubos, seguido de vórtice e inversão do tubo. Em seguida, filtrar o meio preparado com um filtro de seringa de 25 milímetros com filtros de 0,22 micrômetros. Selar todos os meios contidos em tubos cônicos com Parafilm.
Armazenar mídia preparada a quatro graus Celsius. Manter as células cicatrizantes em um frasco de cultura usando DMEM padrão suplementado com 10% FBS, 1% penicilina e estreptomicina. Subcultivar as células cicatrizantes em uma proporção dividida de um para 10 até atingir 80% ou mais de viabilidade celular.
Antes da semeadura das células, submergiu-se a tampa esterilizada de Poli-D-lisina, revestida de laminina, redonda de 12 mm de diâmetro em etanol 70%. Seque as lamínulas da tampa usando lenços sem fiapos e coloque as lamínulas limpas nos poços apropriados da placa. Lave as células uma vez com PBS sem íons magnésio e cálcio.
Adicionar 0,25% de tripsina para dissociar as células de aderência do frasco e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante três minutos. Em seguida, adicione DMEM suplementado com 10% FBS, 1% penicilina e estreptomicina às células. Pipetar suavemente para cima e para baixo.
Recolher as células por centrifugação a 300 G durante três minutos à temperatura ambiente. Em seguida, ressuspender as células em DMEM suplementado com SFB a 0,5% e penicilina e estreptomicina a 1%. Conte as células coradas com azul de tripano usando um hemocitômetro sob um microscópio de luz e semente a uma densidade de duas vezes 10 a quinta células por poço de uma placa de 24 poços.
Distribua as células uniformemente, agitando a placa suavemente. Incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após oito horas, substituir o meio de cultura antigo por óxido de deutério a 50% e fenilalanina em excesso ou óxido de deutério a 50% e excesso de triptofano.
Devolver as células à incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante 36 horas. Agora prepare lâminas de microscópio com espaços de imagem de nove mm de diâmetro. Coloque 15 microlitros de PBS, suplementado com íons cálcio e magnésio e lave as células com a mesma solução.
Adicionar 0,5 mL de solução de paraformaldeído sem metanol a 4% e deixar a placa sob a capa de biossegurança por 15 minutos. Aspirar a solução de paraformaldeído e enxaguar com PBS, suplementado com cálcio e magnésio ferro duas vezes. Adicione um mL de PBS, suplementado com íons cálcio e magnésio a cada poço.
Utilize pinças estéreis para remover as lamínulas de cada poço com cuidado. Inverta-os e coloque a célula que contém o lado sobre os espaços de imagem em contato com o PBS. Sele a camada externa da tampa com o espaçador de imagem usando esmalte transparente.
Coloque a amostra biológica no porta-amostras diretamente abaixo da lente objetiva. Em seguida, clique no ícone da câmera no software para ligar a câmera de vídeo e ajustar o plano de foco para identificar uma região de interesse com a lente objetiva de 50X. Mude para a lente objetiva de 100X.
Clique no ícone de parada para desligar a câmera de vídeo. Em seguida, selecione uma grade de 1.800 linhas por mm e defina a faixa de aquisição de 400 a 3.150 centímetros inversa. Por fim, defina o tempo de aquisição para 90 segundos, o acúmulo para três e o binning para quatro para o espectro menos ruído e mais preciso.
Clique em iniciar para aquecer o laser. Comece pressionando o interruptor principal da caixa de controle IX3CBH para On, seguido pelo interruptor principal do controlador do painel de toque. Em seguida, ligue o interruptor principal do adaptador CA da fonte de alimentação para LDOBIS6 controle remoto a laser conectado ao pente principal do combinador a laser FV31S.
Ligue também o adaptador CA da fonte de alimentação remota a laser LDOBIS6 conectada ao pente do combinador sublaser FV31S. Depois disso, pressione os interruptores principais do detector de fotodiodo SI e ligue o amplificador de bloqueio. Ajuste o laser IR em 1031 nanômetros Ajuste o sistema pico esmeralda para um comprimento de onda ajustável entre 720 e 990 nm.
Monte a amostra sobre o óleo e coloque uma gota de água grande na lâmina do microscópio onde a amostra é fixada. Selecione o tamanho da digitalização como 512 por 512 pixels. Adquira e salve as imagens como um Olimpo.
Arquivo gráfico OIR. Depois de definir o sinal para 862.0, adquira uma imagem de fundo e salve-a. Ajuste o tempo de permanência para oito microssegundos por pixel e o tamanho do pixel para 512 por 512 pixels.
Defina o parâmetro de potência do obturador a laser para 150 miliwatts Para reconstrução de imagem 3D, ajuste a perda Raman estimulada para 2.850 cm inversamente. Uma vez que as células individuais desejadas tenham sido identificadas, registre o laser para escanear a partir do plano de foco superior para detectar as camadas superior e inferior dessas células. O espalhamento Raman estimulado por óxido de deutério, sondado e estimulado, foi usado para visualizar a distribuição espacial dos sinais de CD em células isoladas.
As células controle apresentaram moderadas bandas de CD, lipídios e proteínas. No entanto, a viagem 15 x v e 15 x exibiu proibições mais fortes de lipídios e proteínas da DC. A análise quantitativa indicou que o excesso de aminoácidos aromáticos pode aumentar a síntese lipídica em 10 a 17%, mas diminuir a síntese proteica em 10%A análise métrica das células tratadas com aminoácidos aromáticos mostrou um aumento de 50% na flavina dividida por flavina mais NADH e um aumento de 10% no lipídio insaturado dividido pelo lipídio saturado.
A projeção do volume de gotículas lipídicas Raman 3D estimulada em células cicatrizantes sob controle e condições de excesso de aminoácidos aromáticos são mostradas. Análises quantitativas de gotículas lipídicas 3D mostraram um aumento na contagem, mas uma redução no tamanho nas células tratadas com aminoácidos aromáticos em comparação com o controle. Os parâmetros de imagem para imagens Raman e fluorescentes de dois fótons devem ser otimizados de uma amostra para outra para garantir a melhor qualidade de imagem.
Os indivíduos podem acoplar nosso sistema com a segunda geração harmônica para estudar a estrutura do colágeno, que elucida as alterações metabólicas precoces no envelhecimento e nas doenças, e entender a progressão da neurodegeneração ou do câncer. Nossa tecnologia é a primeira desse tipo a visualizar a síntese de lipídios e proteínas em sistemas biológicos com alta resolução subcelular. A tecnologia também pode ser traduzida para a clínica para detecção de doenças não invasivas.
