Этот протокол описывает недорогой метод проведения анализа жизнеспособности лекарственных средств с использованием органоидов рака яичников, полученных от пациенток. Основными преимуществами данной методики являются использование недорогих и легкодоступных материалов и лабораторного оборудования. Этот метод может быть использован перед проведением дорогостоящих высокопроизводительных скринингов на наркотики.
Несмотря на то, что этот метод связан с проведением анализа жизнеспособности лекарственных средств в органоидах рака яичников, полученных от пациенток, он может быть применен к любой органоидной системе, включая те, которые получены от мышей. Для начала понаблюдайте за базальным мембранным экстрактом или органоидами, содержащими BME, под светлопольным микроскопом, чтобы обеспечить слияние от 70 до 90%. С помощью пипетки добавьте один-два миллилитра предварительно нагретой основной среды в лунку, содержащую органоиды, и механически диссоциируйте органоиды, пипетируя их вверх и вниз.
Перенесите всю органоидную суспензию в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и встряхните трубку в течение 5-10 секунд для дальнейшего разукрупнения клеток. Затем центрифугируют клетки при 1,107 Г в течение пяти минут при комнатной температуре. С помощью одноканальной пипетки отсасывайте и выбросьте надосадочную жидкость.
Повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре реагента органоидной диссоциации, предварительно подогретого до 37 градусов Цельсия, и перенесите суспензию в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную пробирку. Инкубируйте образец в течение семи минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем центрифугируют полученный результат в клеточной суспензии при 1,107 Г в течение пяти минут при комнатной температуре.
После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу ячейки в одном миллилитре предварительно нагретой основной среды. Восстановите клетки в смеси базовых сред и BME, поддерживая конечную концентрацию 20 000 клеток на 10 микролитров. Выложите одну трехмикролитровую каплю ресуспендированных ячеек на лунку черной непрозрачной 96-луночной пластины.
Инкубируйте планшет в инкубаторе клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. Наконец, добавьте 100 микролитров предварительно нагретой современной органоидной среды в каждую лунку перед инкубацией планшета при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24-72 часов. Проводят медикаментозную обработку органоидов через двое суток после их покрытия.
Проведите анализ на жизнеспособность органоидов через семь дней после лечения препаратом. Добавьте в каждую лунку по 100 микролитров реагента для анализа жизнеспособности, доведя общий объем до 200 микролитров, и встряхните пластину при 80 оборотах в минуту в течение пяти минут. Затем дайте планшету инкубироваться при комнатной температуре еще 25 минут.
Тем временем включите считыватель биолюминесцентных пластин и откройте программное обеспечение для управления глазами. Перейдите к подключению к прибору» и выберите Infinite 200Pro«Выберите люминесценцию» и сценарий по умолчанию«Далее в раскрывающемся меню выберите BD 96 FB Falcon BD Falcon 96 Flat Black» в качестве типа пластины для настройки параметров люминесценции. Назначьте затухание как none.
Время интегрирования равно 1000 миллисекундам, а время установления равно нулю миллисекунд. Наконец, откройте пластину, загрузите ее в считыватель пластин и нажмите «Пуск», чтобы начать. Светлопольные изображения были получены для двух различных органоидов, полученных от пациентов, или PDO, используемых в протоколе.
PDO один, полученный из биопсии опухоли, и PDO два, полученный из асцита. Результаты анализа жизнеспособности показали процентное содержание живых клеток в PDO 1 и PDO 2 после того, как оба были обработаны различными концентрациями карбоплатина. Расчетная скорость роста, или значения ГР, была сопоставлена с соответствующими концентрациями карбоплатина, и показатели ГР показали, что значение GR50 для ЗОП было намного выше, чем для ЗОП 2.
Это указывало на то, что PDO 1 был более устойчив к химиотерапии платиной При нанесении покрытия крайне важно, чтобы трехмикролитровая капля клеточной суспензии была помещена непосредственно в центр лунки. Если капля расположена близко к краю лунки, это может привести к ее разрушению, что повлияет на результаты анализа.
