Questo protocollo descrive un metodo a basso costo per l'esecuzione di saggi di vitalità farmacologica utilizzando organoidi di carcinoma ovarico derivati da pazienti. I principali vantaggi di questa tecnica sono l'uso di materiali e attrezzature di laboratorio a basso costo e facilmente reperibili. Questo metodo può essere utilizzato prima di intraprendere costosi screening antidroga ad alto rendimento.
Sebbene il metodo si occupi dell'esecuzione di saggi di fattibilità farmacologica in organoidi di carcinoma ovarico derivati da pazienti, può essere applicato a qualsiasi sistema di organoidi, compresi quelli di derivazione murina. Per iniziare, osservare l'estratto di membrana basale o BME contenente organoidi sotto un microscopio in campo chiaro per garantire una confluenza dal 70 al 90%. Utilizzando una pipetta, aggiungere uno o due millilitri di terreno di base preriscaldato al pozzetto contenente gli organoidi e dissociare meccanicamente gli organoidi pipettandoli su e giù.
Trasferire l'intera sospensione dell'organoide in un tubo conico da 15 millilitri e ruotare il tubo per 5-10 secondi per disaggregare ulteriormente le cellule. Quindi, centrifugare le cellule a 1,107 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Utilizzando una pipetta monocanale, aspirare ed eliminare il surnatante.
Risospendere il pellet in un millilitro di reagente di dissociazione degli organoidi preriscaldato a 37 gradi Celsius e trasferire la sospensione in una micro provetta da centrifuga da 1,5 millilitri. Incubare il campione per sette minuti a 37 gradi Celsius. Quindi centrifugare il risultato in sospensione cellulare a 1,107 G per cinque minuti a temperatura ambiente.
Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in un millilitro di terreno di base preriscaldato. Ricostituire le cellule in una miscela di terreni basici e BME, mantenendo una concentrazione finale di 20.000 cellule per 10 microlitri. Placcare una gocciolina da tre microlitri delle cellule risospese per pozzetto di una piastra nera opaca a 96 pozzetti.
Incubare la piastra in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Infine, aggiungere 100 microlitri di terreno organoide avanzato preriscaldato a ciascun pozzetto prima di incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 24-72 ore. Eseguire il trattamento farmacologico degli organoidi due giorni dopo averli placcati.
Eseguire il test di vitalità sugli organoidi sette giorni dopo il trattamento farmacologico. Aggiungere 100 microlitri di reagente per il saggio di vitalità a ciascun pozzetto, portando il volume totale a 200 microlitri, e agitare la piastra a 80 giri/min per cinque minuti. Quindi lasciare incubare la piastra a temperatura ambiente per altri 25 minuti.
Nel frattempo, accendi il lettore di piastre a bioluminescenza e apri il software di controllo ottico. Naviga per connetterti allo strumento"e seleziona Infinite 200Pro"Seleziona luminescenza"e script predefinito"Successivamente, dal menu a discesa, scegli BD 96 FB Falcon BD Falcon 96 Flat Black"come tipo di piastra per impostare i parametri di luminescenza. Assegnare l'attenuazione come nessuna.
Tempo di integrazione pari a 1000 millisecondi e tempo di assestamento pari a zero millisecondi. Infine, scoprire la piastra, caricarla sul lettore di piastre e premere start"per iniziare. Sono state acquisite immagini in campo chiaro per i due diversi organoidi derivati dal paziente, o PDO, utilizzati nel protocollo.
PDO uno, derivato da una biopsia tumorale e PDO due derivato dall'ascite. I risultati del test di vitalità hanno rivelato la percentuale di cellule vive nel PDO 1 e nel PDO 2 dopo che entrambi sono stati trattati con concentrazioni variabili di carboplatino. Il tasso di crescita calcolato, o valori GR, è stato tracciato rispetto alle corrispondenti concentrazioni di carboplatino e le metriche GR hanno rivelato che il valore GR50 per la DOP uno era molto più alto di quello per la DOP due.
Ciò ha indicato che il PDO era più resistente alla chemioterapia a base di platino Durante la placcatura, è fondamentale che la gocciolina di tre microlitri della sospensione cellulare sia posizionata direttamente al centro del pozzetto. Se la gocciolina viene posizionata vicino al bordo del pozzetto, potrebbe causare il collasso della gocciolina, influenzando i risultati del test.
