Измеряя электрофизиологические свойства клеточных мембран, вопрос главный доказывает, что модулировать электрическую активность клетки можно. Запись цельноклеточного пластыря - это периферийный метод для изучения ионных токов в отдельных клетках и опроса клеточного ответа на различные стимулы. Наилучшая производительность при предварительной записи цельноклеточного пластыря будет достигнута после долгой практики и изучения.
Чтобы начать рассечение мозга, сделайте разрез хирургическими ножницами на коже в верхней части черепа обезглавленного животного от кодлы до ростраля и удалите кожу головы. Далее разрежьте ножницами радужной оболочки межтеменную пластинку вдоль сагиттального шва и удалите затылочную кость. Проденьте остеотом под теменную кость и осторожно вытащите его, пока мозг не обнажится.
Обнажив мозг, переверните голову вверх ногами. Осторожно опустите мозг, чтобы визуализировать тройничный нерв с каждой стороны. Затем разрежьте тройничный нерв с помощью изогнутых ножниц Кастровьехо.
После визуализации гипоталамуса определите зрительный нерв и аккуратно разрежьте его. Далее разрезают дальнюю переднюю часть лобной доли. Извлеките мозг и сразу же погрузите его в раствор для нарезки до получения срезов.
Чтобы нарезать образцы мозга, поместите мозг на фильтровальную бумагу, чтобы высушить излишки раствора. Затем острым режущим лезвием бритвы выполняют коронковый разрез, отделяя ствол мозга с мозжечком от остальных тканей. Затем приклейте кодловую часть мозга к основанию вибратома и заполните камеру нарезочного устройства раствором для нарезки или раствором ликвора, охлажденным до нуля-двух градусов по Цельсию.
Упакуйте сухой лед вокруг вибратомной камеры, чтобы раствор для нарезки оставался холодным во время процедуры. Вставьте лезвие бритвы в вибратом и установите параметры резки устройства, такие как скорость на три, частота на девять и подача на 250 микрометров. Во время процедуры нарезки ткани перенесите срезы с помощью акриловой пипетки в камеру восстановления и подождите 60 минут для восстановления ткани после получения среза.
Перед началом герметизации и записи клеток включите микроскоп, усилитель, дигитайзер и микроманипулятор. Соберите записывающую камеру, прикрепленную к микроскопу, с помощью раствора aCSF. Используйте перфузионный насос для постоянной перфузии aCSF со скоростью два миллилитра в минуту.
Проверьте настройки программного обеспечения и создайте специальные протоколы для записей в соответствии с типом эксперимента. Переносите интересующий вас кусочек мозга по одному в записывающую камеру с помощью акриловой пипетки. Удерживайте срез якорем среза, чтобы он не двигался во время перфузии ликвора.
Расположите срез в центре записывающей камеры, используя объектив иммерсионного микроскопа с низким энергопотреблением, 10X или 20X. Положение среза имеет решающее значение для хорошего обзора нужной области под микроскопом и для идеального доступа к записывающей микропипетке. Найдя интересующую область, переключите линзу объектива на линзу высокой мощности, 63X и сфокусируйтесь на уровне ткани, наблюдая за эндогенным флуоресцентным белком и формами клеток в целевой области, чтобы найти клетки кисспептина на поверхности среза мозга.
Когда возможная целевая ячейка будет найдена, отметьте ее на экране компьютера курсором мыши или нарисовав формат в виде квадрата над интересующей областью. Метка на экране компьютера помогает направлять положение записывающего пипетки к ячейке. После определения точного местоположения клетки-мишени поднимите объектив и введите записывающую микропипетку, заполненную внутренним раствором, в электрододержатель, убедившись, что внутренний раствор находится в контакте с серебряным электродом.
Перед погружением микропипетки в раствор ликвора применяют положительное давление с помощью шприца, наполненного воздухом, объемом от одного до трех миллилитров, соединенного с держателем микропипетки через полиэтиленовую трубку, чтобы предотвратить попадание мусора в микропипетку. С помощью микроманипулятора направьте микропипетку ниже центра объектива. Переместите кнопки микроманипулятора, чтобы направить ось XYZ микропипетки к интересующей ячейке.
Отрегулируйте фокус так, чтобы увидеть кончик микропипетки, и поднесите фокус ближе, но не слишком близко к срезу. Уменьшите скорость микроманипулятора и медленно опустите микропипетку до плоскости фокуса, следя за тем, чтобы наконечник микропипетки не проникал резко в срез, а медленно опускался до тех пор, пока не коснется поверхности клетки или целевой области. Применение легкого положительного давления с помощью шприца, наполненного воздухом, объемом от одного до трех миллилитров, чтобы очистить путь подхода от мусора.
Медленно переместите микроманипулятор по оси XYZ, чтобы приблизить наконечник микропипетки и коснуться клетки-мишени, которая вызывает ямочку под действием приложенного давления. После установления ямочки с помощью режима зажима напряжения на программном обеспечении применяют слабое кратковременное всасывание через рот в течение одной-двух секунд через трубку, соединенную с держателем микропипетки, для создания уплотнения между микропипеткой и ячейкой. Если уплотнение остается механически стабильным без шумовых помех в течение примерно минуты, установите удерживающее напряжение на ближайшем физиологическом потенциале покоя интересующей клетки.
Для кисспептина рекомендуются нейроны гипоталамуса минус 50 милливольт. Затем нанесите короткое отсасывание ртом, чтобы разорвать плазматическую мембрану на запечатанном кончике микропипетки, помещенном в клетку, чтобы разорванная мембрана не закупорила микропипетку и не притянула значительную часть мембраны или клетку. Адекватная конфигурация целой ячейки может быть достигнута путем выполнения всасывания с достаточной силой.
Проверьте используемые системные настройки. После разрыва клеточной мембраны включите опцию «Вся ячейка» в режиме зажима напряжения и нажмите на автоматическую команду, относящуюся ко вкладке «Вся ячейка». Последовательное сопротивление ячейки и емкость всей ячейки автоматически рассчитываются и мгновенно отображаются программным обеспечением.
Далее проверьте параметры жизнеспособности клеток в программном обеспечении, как описано в текстовой рукописи. Контролируйте последовательное сопротивление и емкость ячейки в установившемся состоянии во время экспериментов. После того, как вся конфигурация ячейки будет достигнута должным образом, измерьте синаптические токи в режиме зажима напряжения.
Запишите изменения мембранного потенциала покоя и индуцированные изменения мембранного потенциала покоя в режиме токового зажима. Возможное влияние человеческого рекомбинантного гормона роста на активность гипоталамических кисспептиновых нейронов изучали с помощью записей цельноклеточных пластырей. Введение человеческого рекомбинантного гормона роста, HGH в дозе 20 мкг на грамм, вызвало значительную гиперполяризацию мембранного потенциала покоя в 5 из 12 нейронов кисспептина AVPV / PeN и 9 из 14 зарегистрированных нейронов кисспептина ARH.
Гиперполяризованные нейроны кисспептина AVPV / PeN и кисспептина ARH значительно изменяли мембранный потенциал покоя по сравнению с невосприимчивыми клетками. Влияние на мембранный потенциал покоя во время применения гормона роста сопровождалось значительным снижением входного сопротивления всей клетки примерно на 0,9–0,7 гигаома на нейронах кисспептина AVPV / PeN и от 1,7 до 1,0 гигаома на нейронах кисспептина ARH. Во время идеальных линий мозга, выполняемых с помощью тщательного гигасила, и площади в клетке с помощью пляжных параметров необходимы параметры для достижения наилучших записей целых клеток.
Раствор микропипетки зарегистрированной клетки может быть собран и использован для одноклеточной RTPCR, что позволяет молекулярную характеристику изолированной клетки. Метод цельноклеточного пластыря в сочетании с использованием генетически модифицированных животных представляет собой прорыв в понимании размножения, позволяющий определить повышенные свойства нейронов кисспептина, и они являются основными модуляторами.
