Немногие методы позволяют быстро оценить функциональность гемопоэтических предшественников. Этот протокол измеряет влияние первых делений клеток на судьбу и приверженность клеток. Этот протокол позволяет одновременно измерять деление и дифференцировку на уровне отдельных клеток и с высокой пропускной способностью, не требуя сложных и обширных манипуляций.
Этот метод подходит для любой кроветворной популяции, которая может поддерживаться в культуре. Таким образом, его можно легко применить к биологии рака, иммунологии и биологии развития. Для начала аликвотируйте 250 микролитров фракции CD34+ поровну в четырех полипропиленовых тубах по 15 миллилитров.
Пометьте трубки, как описано в текстовой рукописи. Перелейте 250 микролитров фракции CD34 в еще четыре полипропиленовые пробирки по 15 миллилитров и промаркируйте пробирки. Подготовьте растворы CFSE с высоким и CSFE с низким, как описано в текстовой рукописи.
Добавьте 250 микролитров высокого раствора CFSE в пробирку CF и CV, 250 микролитров низкого раствора CFSE в пробирку VC и 250 микролитров модифицированной среды орла Дульбекко, или DMEM, без эмбриональной бычьей сыворотки, или FBS, в VI пробирку. Чтобы обеспечить эффективное смешивание клеточной суспензии с клеточным красителем, наклоните пробирку на 90 градусов и нанесите растворы CFSE на стенку пробирки. Затем держите пробирку вертикально и перемешайте три или четыре раза, чтобы обеспечить быстрое смешивание растворов CFSE с ресуспендированными ячейками.
Инкубируйте суспензию при температуре 37 градусов Цельсия в течение восьми минут. После инкубации добавьте пять миллилитров DMEM, содержащего 10% FBS, и поместите пробирки при температуре 37 градусов Цельсия на пять минут. Крутите тюбики при 300 G в течение пяти минут.
Удалите надосадочную жидкость с помощью аспирации, не нарушая гранулы, и промойте гранулы пятью миллилитрами PBS, ETDA. Снова раскрутите трубки и выбросьте надосадочную жидкость перед ресуспендированием гранулы в 40 микролитрах PBS, ETDA. Чтобы окрасить клетки CD34+, приготовьте основную смесь антител в одну пробирку объемом 0,5 миллилитра.
Добавьте семь микролитров из основной смеси антител к каждому из четырех условий CD34+. Ресуспендируют клетки в окрашивающем буфере, используя приблизительно 500 микролитров каждый для шариков в клетках CD34 + и один миллилитр для пробирок CD34. Для сортировки ячеек задайте стратегию стробирования, создав точечные диаграммы.
Во-первых, визуализируйте ячейки на точечном графике FSCA и SSCA и дважды щелкните инструмент стробирования полигонов, чтобы выбрать популяцию с низким боковым разбросом. Пометьте эти вновь созданные ворота как ячейки. На следующем точечном графике, FSCA и FSCH, щелкните правой кнопкой мыши график и выберите ячейки ворот из раскрывающегося меню, щелкнув по нему.
Используйте тот же инструмент стробирования, чтобы выбрать плотную популяцию по диагонали между двумя осями. Пометьте эти ворота как одиночные ячейки. На третьем точечном графике, APC против FSH-H, отображают популяционные одиночные клетки и заворачивают клетки, отрицательные для экспрессии линии APC.
Пометьте эту вновь созданную популяцию как Lineage Negative. На четвертом графике, CFSE против CTV, отобразите отрицательную родословную населения и создайте четыре отдельных ворота, по одному для каждой комбинации красителей. Ворота VI показаны здесь в качестве примера.
Используйте пятый и шестой сюжеты, чтобы определить интересующих прародителей. Щедро закладываем CD34+CD38-популяцию и CD34+CD38+на пятом участке. Затем выберите популяцию CD34 + CD38 на шестом графике и нарисуйте три ворота для LMPP, HSC и MPP.
Запустите дроби CD34+, записав не менее 5 000 событий в одноячеечном затворе. Отрегулируйте затвор для каждой комбинации красителей, установив плотный затвор для выбора однородной популяции. Подготовьте шаблон сортировки тарелок с помощью макета «Экспериментальная сортировка».
Скважины, названные CD34, содержат от 5 000 до 10 000 ячеек, отсортированных на затворе CF, CV, VC, VI. Объемные лунки содержат 500 ячеек, отсортированных на затворе CD34 + CD38-Одноячеистые лунки содержат только одно событие на комбинацию красителя деления клеток на лунку, то есть всего четыре события на лунку. Затем начните с сортировки CD34-CF в режиме чистоты выхода.
Нажмите кнопку «Получить», а затем кнопку «Сортировка». Нажмите «Получить», затем кнопку «Сортировать», убедившись, что вы отметили 0160 как степень чистоты. Наконец, отсортируйте интересующие ячейки, по одной ячейке на лунку, по чистоте одной ячейки, убедившись, что вы отметили опцию «Сортировка по индексу».
Центрифугируйте тарелку при 300 G в течение пяти минут и удалите надосадочную жидкость, быстро перевернув пластину под капюшоном поверх бумажного полотенца. Добавьте восемь микролитров стоячего буфера в лунки от A1 до A4, а затем добавьте восемь микролитров смеси в другие лунки. Промойте клетки, добавив 100 микролитров окрашивающего буфера на лунку с помощью многоканальной пипетки.
Центрифугируют и удаляют надосадочную жидкость перед ресуспендированием клеток в 85 микролитрах окрашивающего буфера. Запустите анализ на проточном цитометре в режиме сбора, используя специальный шаблон и нажав «Пользовательский». После выбора интересующих флуорофоров из списка установите настройку планшета в соответствии с шаблоном планшета, скорректированным на количество лунок, содержащих хотя бы одну ячейку.
Отметьте опцию «Перемешивание» и выберите 100 микролитров в качестве предела объема сбора. Затем установите скорость сбора данных, не превышающую один микролитр в секунду, так как более низкая скорость улучшает общий объем анализируемой скважины. Для репрезентативного стробирования объедините различные объемные скважины в один файл.
После нажатия на опцию «Объединить популяции» выберите «Все некомпенсированные параметры» в меню «Параметры», затем нажмите «Объединить». Загрузите объединенный файл в рабочую область, затем примените матрицу компенсации с помощью перетаскивания. Метки ячеек с CV и VC нуждаются в преобразованном значении.
Нажмите «Инструменты» и «Производный параметр», чтобы получить преобразованное значение. Вставьте указанную формулу в поле формулы. Примените стробирование к каждому цвету в отдельности в виде гистограммы.
Для CF и VI установите CFSE-A и CTV-A на оси X соответственно. Для CV и VC установите новый производный параметр на оси X, затем установите вентили, соответствующие каждому пику. Примените стробирование к каждой отдельной отдельной ячейке.
Обязательно добавьте производный параметр в каждую анализируемую скважину. Вручную проверяйте каждый цветной затвор для каждой скважины, чтобы обнаружить события, которые неправильно назначены заданному пику. Анализ проточной цитометрии после культивирования клеток требует точного стробирования для установления родства каждой отдельной клетки наряду с клеточным фенотипированием.
Определение и назначение пика являются важнейшими аспектами анализа проточной цитометрии. На гистограммах показаны два примера семейств, распределенных по нескольким пикам: один из двух одинаковых пиков интенсивности и один с двумя разными пиками интенсивности. Здесь показаны различные типы представления данных и статистического тестирования для двух отдельных экспериментов, проведенных через 72 часа для ГСК и МПП.
Тепловая карта дифференцировки ГСК состояния представляет различные семейства клеток, как в клеточных судьбах, так и в клеточных делениях. Здесь показана гистограмма, сравнивающая судьбу семейств клеток, полученных из ГСК и МПП. Для обоих типов клеток сравнение между состоянием GT и дифференцировкой состояния отображается вместе со статистическими тестами, выполненными для MPP.
Здесь показаны гистограммы, сравнивающие процент семейств клеток в поколении и тип симметрии или асимметрии в судьбе для первого деления. Здесь показано распределение судеб по поколениям для MPP и дифференциация состояний. Эта процедура требует массовой изоляции ячеек, чтобы установить соответствующую стратегию стробирования.
Поэтому окрашивание лучше начинать как минимум с 10 000 клеток. Сочетание этого метода с непрерывным измерением, как воображение живых клеток, может быть очень мощным, поскольку они вместе могут дать подробное описание ранних предшественников клеточной динамики. Этот подход был впервые разработан для биологии Т-клеток лабораторией Хопкинса.
Эта версия, адаптированная для стволовых клеток крови, в настоящее время распространяется на рак и биологию стволовых клеток.
