Этот метод обеспечивает технику выделения нуклеиновых кислот из определенных популяций клеток яичников от одной и той же мыши без необходимости сортировки клеток. Этот метод может помочь определить, как конкретные клеточные популяции изменяются при различных условиях. Например, со старением.
Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет проводить парный эпигеномный и транскриптомный анализ определенного типа клеток яичников без необходимости сортировки клеток. Это значительно увеличивает пропускную способность, снижает стоимость и устраняет необходимость в специализированном оборудовании при проведении типоспецифического анализа клеток из ткани яичника. Здесь наша цель состоит в том, чтобы идентифицировать специфические для типа клеток изменения, которые происходят при старении яичников до репродуктивного старения, что имеет значение при лечении женского бесплодия.
Этот метод может быть применен к любому типу клеток в системах организма, для которых доступен специфический для типа клеток драйвер Cre. Самая сложная часть этого метода - выбрать подходящую линию Cre для интересующего вас типа клеток. Рекомендуется обширная проверка клеточной специфичности.
Для начала соберите один яичник у усыпленной мыши в 500 микролитров буфера для лизиса ядер и разрежьте яичник на восемь частей внутри буфера с помощью самооткрывающихся микроножниц. Переложите измельченную завязь и буфер для лизиса в стеклянный гомогенизатор на льду и гомогенизируйте завязь от 10 до 20 раз рыхлым пестиком A. Добавьте 400 микролитров буфера для лизиса в пестик для мытья гомогенизатора A. А затем гомогенизируйте завязь плотным пестиком B от 10 до 20 раз. Переложите гомогенат в двухмиллилитровую пробирку с круглым дном и центрифугу при 200 г в течение 1,5 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить недиссоциированные ткани и кровеносные сосуды.
После предварительного смачивания 30-микрометрового сетчатого фильтра со 100 микролитрами лизисного буфера отфильтруйте надосадочную жидкость через сетчатый фильтр в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Переложите содержащие ядра смесь в двухмиллилитровую трубку с круглым дном. Центрифугируйте образец при 500 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и выбросьте надосадочную жидкость.
Ресуспендируйте гранулу ядер в 250 микролитрах ледяного буфера для лизиса путем кратковременного вихряния с умеренной или высокой скоростью. Доведите объем до 1,75 миллилитра, добавив 1,5 миллилитра буфера для лизиса. Аккуратно перемешайте и положите суспензию ядер на лед на пять минут.
Гранулируйте ядра центрифугированием при 500 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. И аккуратно выбросьте надосадочную жидкость, не нарушая гранулы ядер. Ресуспендируйте гранулу в 200 микролитрах ледяного буфера для хранения и ненадолго встряхните, чтобы полностью ресуспендировать гранулу ядер.
Зарезервируйте 10% ресуспендированной гранулы в качестве образца входных ядер для последующего анализа. Возьмите поддон с ресуспендированными ядрами и доведите объем до двух миллилитров с помощью ледяного буфера ядерной очистки, или NPB. Добавьте 30 микролитров ресуспендированных шариков для каждого образца в двухмиллилитровую пробирку с круглым дном.
Затем добавьте один миллилитр NPB и хорошо ресуспендируйте пипеткой. Поместите трубку на магнитную стойку на одну минуту, чтобы отделить бусины. Выбросьте надосадочную жидкость и снимите трубку с магнита.
Ресуспендируйте промытые магнитные шарики в одном миллилитре NPB. Повторите этап стирки в общей сложности три стирки. А после окончательной стирки ресуспендировать шарики в исходном объеме NPB.
Добавьте 30 микролитров промытых шариков к двум миллилитрам ядерной суспензии и хорошо ресуспендируйте смесь ядер шариков, пипетируя и осторожно инвертируя трубку. Поместите пробирки на вращающийся смеситель в холодильную камеру или холодильник на 30 минут на низкой скорости и инкубируйте входные образцы без шариков в тех же условиях. Поместите трубки с суспензией ядер и шариками на магнит на три минуты, чтобы отделить биотинилированные ядра, связанные с шариками стрептавидина, от отрицательной фракции ядер.
Удалите надосадочную жидкость. Передайте отрицательную фракцию в свежую двухмиллилитровую пробирку и оставьте ее на льду. Для каждой трубки с положительной фракцией снимите трубку с магнита и ресуспендируйте содержимое в одном миллилитре NPB.
Поместите трубку на магнит на одну минуту и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендировать смесь ядер шариков положительной фракции в 30 микролитрах NPB. Перенесите завязь и 100 микролитров буфера гомогенизации в стеклянный гомогенизатор и гомогенизируйте от 10 до 20 раз рыхлым пестиком A. Добавьте 400 микролитров буфера гомогенизации TRAP в промывочный пестик A и перелейте гомогенат в двухмиллилитровую пробирку с круглым дном.
Промойте гомогенизатор дополнительным одним миллилитром буфера гомогенизации TRAP и перенесите промытый объем в двухмиллилитровую пробирку с круглым дном. Центрифугируйте гомогенат при 12 000 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. И переложите очищенную надосадочную жидкость в свежую двухмиллилитровую трубку с круглым дном.
После выброса гранул перелейте 100 микролитров очищенного гомогената в свежую двухмиллилитровую пробирку с круглым дном и зарезервируйте ее в качестве входных данных на льду. Инкубируйте оставшуюся часть очищенного гомогената с пятью микрограммами на миллилитр антитела против GFP в течение одного часа при четырех градусах Цельсия, вращая в смесителе «конец за концом». Инкубируйте входной образец в том же состоянии.
Перенесите 50 микролитров магнитных шариков белка G для каждого образца в двухмиллилитровую пробирку с круглым дном. Добавьте 500 микролитров промывочного буфера с низким содержанием соли к шарикам и аккуратно перемешайте. Поместите трубку в магнитную подставку на одну минуту, чтобы собрать шарики на боковой стороне трубки.
После удаления надосадочной жидкости снимите трубку с магнитной подставки и добавьте в пробирку один миллилитр буфера для промывки с низким содержанием соли. Пипеткой аккуратно перемешать. Снова поместите трубку в магнитную подставку и повторите этот шаг, в общей сложности три стирки.
После окончательной стирки ресуспендируйте шарики в начальном объеме буфера для стирки с низким содержанием соли. Перенесите ресуспендированные промытые шарики в смесь антител образца антигена и инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение ночи, вращая в смесителе «конец за концом». Инкубируйте входные образцы в течение ночи в эквивалентных условиях.
После этого отделите положительную фракцию или магнитные шарики с целевой РНК рибосом от отрицательной фракции или надосадочной жидкости с помощью магнитного стенда в течение 2,5-3 минут. Аспирируйте отрицательную дробь. Поместите его в свежую двухмиллилитровую трубку с круглым дном и отложите на лед.
Добавьте 500 микролитров буфера для промывки с высоким содержанием соли в пробирку с положительной фракцией и аккуратно перемешайте пипеткой. Поместите трубку на магнитную подставку, поддерживаемую на льду в течение одной минуты, чтобы отделить шарики. После удаления надосадочной жидкости снимите трубку с магнита и повторите этот шаг, в общей сложности три промывки.
После окончательной промывки ресуспендируйте шарики в 350 микролитрах буфера для лизиса РНК, дополненного 3,5 микролитрами 2-меркаптоэтанола. Инкубируйте пробирки при комнатной температуре, перемешивая в течение 10 минут при 900 об/мин в цифровом шейкере. Отделите шарики от раствора, который теперь содержит целевую РНК рибосом, с помощью магнитной подставки в течение одной минуты при комнатной температуре.
Соберите элюированную положительную фракцию в свежую пробирку объемом 1,5 миллилитра. Иммунофлуоресцентная визуализация проводилась на парафинизированных яичниках мышей Cyp17-Cre с положительным NuTRAP flox и Cyp17-Cre с отрицательным NuTRAP flox. Белок EGFP окрашивали с использованием первичного антитела козы против GFP и вторичного антитела против осла Alexa 488 против козы, а ядра окрашивали DAPI.
Изображения были сделаны на флуоресцентном микроскопе при 20-кратном увеличении. Входная и TRAP-положительная фракционная РНК были выделены из яичников мыши NuTRAP flox с положительным результатом Cyp17-Cre и секвенированы парным концевым способом. Анализ главных компонент всех экспрессируемых генов показал разделение входных и положительных фракций TRAP в первом компоненте.
Здесь показан вулканический график дифференциально экспрессируемых генов между входной и положительной фракциями. Сравнение положительной фракции TRAP с входом показало общее обогащение генов-маркеров стромы/тека-клеток и истощение генов-маркеров ооцитов, гранулез, иммунных и гладкомышечных клеток в TRAP-положительной фракции. После первого центрифугирования ядерной суспензии для удаления недиссоциированных кровеносных сосудов ядра оказываются в надосадочной жидкости.
Обязательно сохраните надосадочную жидкость и выбросьте гранулы на этом этапе. Следуя интактному методу, можно провести несколько эпигеномных методов, включая анализы доступности хроматина или модификации ДНК среди других. Следуя методу TRAP, для оценки транслатома можно провести ОТ-кСЛР или секвенирование РНК.
Это первое применение метода NuTRAP в яичнике мыши. Это позволяет проводить высокопроизводительный эпигеномный и транскриптомный анализ определенных типов клеток яичников, который может быть использован для изучения старения яичников или рака.
