Diese Methode bietet eine Technik, um Nukleinsäuren aus bestimmten Eierstockzellpopulationen derselben Maus zu isolieren, ohne dass eine Zellsortierung erforderlich ist. Diese Technik kann dabei helfen, herauszufinden, wie sich bestimmte Zellpopulationen unter verschiedenen Bedingungen verändern. Zum Beispiel mit dem Altern.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine paarweise epigenomische und transkriptomische Analyse eines bestimmten ovariellen Zelltyps ermöglicht, ohne dass eine Zellsortierung erforderlich ist. Dies erhöht den Durchsatz erheblich, senkt die Kosten und macht spezielle Geräte bei der Durchführung von zelltypspezifischen Analysen aus Eierstockgewebe überflüssig. Unser Ziel ist es, die zelltypspezifischen Veränderungen zu identifizieren, die mit der Alterung der Eierstöcke vor der reproduktiven Seneszenz auftreten, was Auswirkungen auf die Behandlung der weiblichen Unfruchtbarkeit hat.
Diese Methode kann auf jeden Zelltyp über Körpersysteme hinweg angewendet werden, für den ein zelltypspezifischer Cre-Treiber verfügbar ist. Der schwierigste Teil dieser Technik ist die Auswahl einer geeigneten Cre-Linie für den gewünschten Zelltyp. Eine umfangreiche Validierung der Zellspezifität wird empfohlen.
Sammeln Sie zunächst einen Eierstock der euthanasierten Maus in 500 Mikrolitern Zellkernlysepuffer und zerhacken Sie den Eierstock innerhalb des Puffers mit einer selbstöffnenden Mikroschere in acht Teile. Übertragen Sie den gehackten Eierstock und den Lysepuffer in einen Glas-Dounce-Homogenisator auf Eis und homogenisieren Sie den Eierstock 10 bis 20 Mal mit dem losen Stößel A.Geben Sie 400 Mikroliter Lysepuffer in den Dounce-Homogenisator-Waschstößel A.Und homogenisieren Sie dann den Eierstock mit festem Stößel B 10 bis 20 Mal. Das Homogenat wird in ein zwei Milliliter fassendes Röhrchen mit rundem Boden umgefüllt und bei 200 g 1,5 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert, um das nicht dissoziierte Gewebe und die Blutgefäße zu entfernen.
Nach der Vorbenetzung eines 30-Mikrometer-Zellsiebs mit 100 Mikrolitern Lysepuffer wird der Überstand durch das Sieb in ein 15-Milliliter-Konusrohr filtriert. Übertragen Sie die mit den Kernen enthaltende Mischung in ein zwei Milliliter fassendes Röhrchen mit rundem Boden. Zentrifugieren Sie die Probe bei 500 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie den Überstand.
Resuspendieren Sie das Kernpellet in 250 Mikrolitern eiskaltem Lysepuffer durch kurzes Vortexen bei mittlerer bis hoher Geschwindigkeit. Erhöhen Sie das Volumen auf 1,75 Milliliter, indem Sie 1,5 Milliliter Lysepuffer hinzufügen. Vorsichtig mischen und die Kernsuspension fünf Minuten lang auf Eis ruhen lassen.
Pelletieren Sie die Kerne durch Zentrifugieren bei 500 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Kernpellet zu stören. Resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern eiskaltem Lagerpuffer und wirbeln Sie kurz, um das Kernpellet vollständig zu resuspendieren.
Reservieren Sie 10 % des resuspendierten Pellets als Eingangskernprobe für die nachgelagerte Analyse. Nehmen Sie die Palette für resuspendierte Kerne und füllen Sie das Volumen mit eiskaltem Kernreinigungspuffer (NPB) auf zwei Milliliter auf. Geben Sie 30 Mikroliter resuspendierte Beads für jede Probe in ein zwei Milliliter fassendes Rundbodenröhrchen.
Dann einen Milliliter NPB hinzufügen und durch Pipettieren gut resuspendieren. Legen Sie das Röhrchen für eine Minute auf das Magnetgestell, um die Perlen zu trennen. Entsorgen Sie den Überstand und entfernen Sie das Röhrchen vom Magneten.
Resuspendieren Sie die gewaschenen magnetischen Kügelchen in einem Milliliter NPB. Wiederholen Sie den Waschschritt für insgesamt drei Wäschen. Und nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie die Perlen im ursprünglichen Volumen von NPB.
Geben Sie 30 Mikroliter der gewaschenen Kügelchen zu zwei Millilitern der Kernsuspension und resuspendieren Sie die Beads-Kernmischung gut, indem Sie das Röhrchen pipettieren und vorsichtig invertieren. Legen Sie die Röhrchen für 30 Minuten bei niedriger Geschwindigkeit auf einen rotierenden Mischer in einem Kühlraum oder Kühlschrank und inkubieren Sie die Eingangsproben ohne Perlen unter den gleichen Bedingungen. Legen Sie die Röhrchen mit der Kernsuspension und den Kügelchen drei Minuten lang auf den Magneten, um die biotinylierten Kerne, die an Streptavidin-Kügelchen gebunden sind, von der negativen Fraktion der Kerne zu trennen.
Entfernen Sie den Überstand. Geben Sie die negative Fraktion in ein frisches Zwei-Milliliter-Röhrchen und bewahren Sie es auf Eis auf. Entfernen Sie für jedes Röhrchen mit positiver Fraktion das Röhrchen vom Magneten und resuspendieren Sie den Inhalt in einem Milliliter NPB.
Legen Sie das Röhrchen für eine Minute auf den Magneten und entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Bead-Kernmischung mit positiver Fraktion in 30 Mikrolitern NPB. Übertragen Sie den Eierstock und 100 Mikroliter Homogenisierungspuffer in einen Glas-Dounce-Homogenisator und homogenisieren Sie ihn 10 bis 20 Mal mit dem losen Stößel A. Geben Sie 400 Mikroliter TRAP-Homogenisierungspuffer in den Waschstößel A und füllen Sie das Homogenat in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden.
Waschen Sie den Homogenisator mit einem zusätzlichen Milliliter TRAP Homogenisierungspuffer und füllen Sie das gewaschene Volumen in das zwei Milliliter fassende Rundbodenrohr um. Zentrifugieren Sie das Homogenat bei 12.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Und geben Sie den gereinigten Überstand in ein frisches Zwei-Milliliter-Rundbodenrohr.
Nachdem Sie das Pellet entsorgt haben, geben Sie 100 Mikroliter des geklärten Homogenats in ein frisches Zwei-Milliliter-Rundbodenrohr und reservieren Sie es als Input auf Eis. Inkubieren Sie den Rest des geklärten Homogenats mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Anti-GFP-Antikörper für eine Stunde bei vier Grad Celsius, während Sie in einem End-über-End-Mischer rotieren. Inkubieren Sie die Eingangsprobe unter dem gleichen Zustand.
Übertragen Sie für jede Probe 50 Mikroliter der magnetischen Beads des Proteins G in ein zwei Milliliter fassendes Röhrchen mit rundem Boden. Geben Sie 500 Mikroliter salzarmen Waschpuffer zu den Kügelchen und pipettieren Sie sie vorsichtig, um sie zu mischen. Legen Sie die Röhre für eine Minute in einen magnetischen Ständer, um die Perlen an der Seite der Röhre zu sammeln.
Nachdem Sie den Überstand entsorgt haben, nehmen Sie das Röhrchen vom Magnetständer und geben Sie einen Milliliter salzarmen Waschpuffer in das Röhrchen. Zum Mischen vorsichtig pipettieren. Legen Sie die Tube erneut in den Magnetständer und wiederholen Sie den Schritt für insgesamt drei Wäschen.
Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie die Perlen im ursprünglichen Volumen des salzarmen Waschpuffers. Übertragen Sie die resuspendierten gewaschenen Kügelchen in die Antikörpermischung der Antigenprobe und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius, während sie in einem End-to-End-Mischer rotieren. Inkubieren Sie die Eingangsproben über Nacht unter den entsprechenden Bedingungen.
Danach trennen Sie die positive Fraktion oder die magnetischen Beads mit der Ziel-Ribosomen-RNA für 2,5 bis 3 Minuten von der negativen Fraktion oder dem Überstand mit dem Magnetständer. Sauge den negativen Bruch ab. Legen Sie es in ein frisches zwei-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden und legen Sie es auf Eis beiseite.
500 Mikroliter Waschpuffer mit hohem Salzgehalt in das Röhrchen mit der positiven Fraktion geben und vorsichtig pipettieren, um zu mischen. Legen Sie das Röhrchen eine Minute lang auf einen Magnetständer, der auf Eis gehalten wird, um die Kügelchen zu trennen. Nachdem Sie den Überstand entsorgt haben, entfernen Sie den Schlauch vom Magneten und wiederholen Sie den Schritt für insgesamt drei Wäschen.
Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie die Kügelchen in 350 Mikrolitern RNA-Lysepuffer, ergänzt mit 3,5 Mikrolitern 2-Mercaptoethanol. Inkubieren Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur und mischen Sie sie 10 Minuten lang bei 900 U/min in einem digitalen Shaker. Trennen Sie die Kügelchen mit einem magnetischen Ständer für eine Minute bei Raumtemperatur von der Lösung, die nun die RNA der Zielribosomen enthält.
Sammeln Sie die eluierte positive Fraktion in einem frischen 1,5-Milliliter-Röhrchen. Die Immunfluoreszenzbildgebung wurde an den paraffinisierten Ovarien von Cyp17-Cre-positiven NuTRAP-flox- und Cyp17-Cre-negativen NuTRAP-flox-Mäusen durchgeführt. Das EGFP-Protein wurde mit einem Ziegen-Anti-GFP-Primärantikörper und einem Alexa 488 Esel-Anti-Ziegen-Sekundärantikörper gefärbt, und die Zellkerne wurden mit DAPI gefärbt.
Die Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 20-facher Vergrößerung aufgenommen. Die Eingangs- und TRAP-positive Fraktions-RNA wurde aus Cyp17-Cre-positiven NuTRAP-Flox-Mausovarien isoliert und paarweise sequenziert. Die Hauptkomponentenanalyse aller exprimierten Gene zeigte eine Trennung des TRAP-Inputs und der positiven Anteile in der ersten Komponente.
Das Vulkandiagramm der differentiell exprimierten Gene zwischen den Eingangs- und positiven Anteilen ist hier dargestellt. Der Vergleich der TRAP-positiven Fraktion mit der Eingabe zeigte eine Gesamtanreicherung der Stroma/Theka-Zell-Markergene und die Depletion der Eizell-, Granulosa-, Immun- und glatten Muskelzell-Markergene in der TRAP-positiven Fraktion. Nach der ersten Zentrifugation der Kernsuspension zur Entfernung nicht dissoziierter Blutgefäße befinden sich die Kerne im Überstand.
Achten Sie darauf, den Überstand zu behalten und das Pellet an dieser Stelle zu entsorgen. Nach der intakten Methode können verschiedene epigenomische Techniken durchgeführt werden, darunter Assays für die Zugänglichkeit von Chromatin oder DNA-Modifikationen. Nach der TRAP-Methode kann eine RT-qCPR- oder RNA-Sequenzierung durchgeführt werden, um das Translatom zu beurteilen.
Dies ist die erste Anwendung der NuTRAP-Methode im Eierstock der Maus. Dies ermöglicht eine epigenomische und transkriptomische Hochdurchsatzanalyse von bestimmten Eierstockzelltypen, die zur Untersuchung der Alterung der Eierstöcke oder von Krebs verwendet werden kann.
