Этот метод позволяет разработать стандартизированную систему, которую легко настроить из клеточных линий человека или первичных клеточных популяций и обеспечивает особенности хорошо организованной, похожей на костный мозг структуры. Эта модель позволяет собирать клетки после фиксации для характеристики локализации клеток in situ в системе с помощью визуализации или диссоциации 3D-структуры для сбора каждого клеточного компонента для молекулярных или функциональных исследований. Продемонстрировать процедуру будет Кевин Гейстлих, помощник инженера из моей лаборатории.
Взвесьте от 35 до 40 миллиграммов бусин BCP в 1,5-миллилитровой трубке для каждой вставки. То есть небольшая цилиндрическая пластиковая тарелка с поликарбонатной мембраной внизу. Просверлите небольшое отверстие с чистой иглой через верхнюю часть 1,5-миллилитровой трубки, чтобы крышка не распахнулась во время цикла автоклава, и поместите трубки в вертикальное положение в закрытую стерильную коробку.
Поместите стерильные поликарбонатные вставки для посевных клеток в колодцы шестилуночной пластины. Вылейте в вставку стерильные шарики BCP из 1,5-миллилитровой трубки. Тщательно вымойте бусины, капнув внутрь вставки 350 микролитров 1X PBS, а затем добавьте 4,5 миллилитра 1X PBS в колодец.
Выбросьте PBS с помощью вакуума или пятимиллилитровой пипетки, поместив наконечник в угол колодца. Повторите этап стирки дважды. Затем используйте 1X PBS, дополненный 10% FBS, чтобы заблокировать систему.
Осторожно добавьте 350 микролитров блокирующего раствора во вставку и 4,5 миллилитра в лунку, и поместите всю пластину в инкубатор на ночь. Удалите блокирующее решение из системы. Смешайте 1 раз 10 с 6 клетками HMEC-1 и 2 раза по 10 с 6 клетками HS27A, представляющими сосудистые и мезенхимальные стромальные клеточные компартменты соответственно, в 15-миллилитровой трубке и центрифуге в течение пяти минут при 1 575 г при комнатной температуре.
Откажитесь от супернатанта и добавьте 175 микролитров среды HMEC-1, дополненных 175 микролитрами ODM, которые будут способствовать дифференцировке мезенхимальных стромальных клеток в остеобласты. Залейте 350 микролитров клеточной суспензии, содержащей 3 раза по 10 до 6 общих ячеек внутри каждой вставки. Затем перелейте 4,5 миллилитра объединенной среды без ячеек в лунки пластины.
Осторожно аспирируйте и дозируйте смесь несколько раз с помощью микропипетки в один миллилитр, чтобы гомогенизировать клетки и шарики BCP внутри вставки. Дайте всей смеси осесть в нижней части вкладыша. Как только эндотелиальные и мезенхимальные клетки гомогенизируются внутри вставки, держите шестилуночную пластину внутри инкубатора в течение трех недель.
Меняйте среду внутри вставки в лунке два раза в неделю, осторожно удаляя среду с помощью микропипетки в один миллилитр и размещая наконечник у внутренней стенки вставки, чтобы не нарушить угол вставки. Повторно суспендируют интересующие гематологические клетки в комбинированной среде HMEC-1 и RPMI и добавляют клеточную суспензию во вставку. На этом шаге могут быть добавлены другие типы клеток, представляющих интерес с выделенными носителями.
Если требуется протокол медикаментозного лечения, подождите 24 часа после добавления интересующих клеток, прежде чем лечить их, давая им время прилипнуть к костно-подобной структуре. Обновляйте среду с 50% HMEC-1 полной средой и 50% RPMI полной средой два раза в неделю. После смены питательной среды два раза в неделю храните извлеченный супернатант из внутренней части вкладыша при минус 80 градусах Цельсия, чтобы оценить выработку белка в системе.
Чтобы диссоциировать клетки от 3D-структуры, смешайте 4,5 миллилитра RPMI с 0,5 миллилитрами FBS, дополненные 0,4 миллиграмма на миллилитр коллагеназы в 15-миллилитровой трубке. Затем прогрейте раствор при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут. Поместите вставку вверх ногами на стерильную крышку пластины с шестью лунками, чтобы правильно вырезать мембрану.
Используйте стерильный скальпель, чтобы разрезать мембрану с боков, таким образом извлекая белый твердый диск. Поместите диск внутрь теплой 15-миллилитровой трубки, содержащей раствор смеси, приготовленной ранее. Поместите трубку в активное колесо в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и инкубируйте в течение 10 минут, чтобы обеспечить пищеварение.
Применяйте одинаковое время инкубации для всех мембран, чтобы избежать искаженного анализа. После инкубации центрифугируют 15-миллилитровую трубку в течение пяти минут при 1 575 г при комнатной температуре. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах теплого 1X PBS.
Повторно суспендируйте гранулу в 300 микролитров теплого трипсина и хорошо перемешайте путем пипетки в течение 10 секунд и поместите ее на водяную баню, установленную при 37 градусах Цельсия в течение одной минуты. Остановите ферментативное пищеварение, добавив один миллилитр теплого, чистого FBS. С помощью микропипетки в один миллилитр механически аспирировать и дозировать среду, чтобы полностью диссоциировать диск.
Центрифугируйте трубку в течение пяти минут при 1, 575 г и повторно суспендируйте гранулу в трех миллилитрах 1X PBS с добавлением 10% FBS. Оставьте шарики в осадок в течение пяти секунд, прежде чем собирать супернатант и фильтровать его через 35-микронный клеточный сетчатый фильтр, помещенный на сборную трубку. Центрифугируйте извлеченный фильтрат в течение пяти минут при 1 575 г и подсчитайте клетки с трипан-синим цветом, чтобы оценить жизнеспособность.
Повторно суспендировать гранулы в смеси антител и инкубировать в течение 30-40 минут на льду вдали от света. Добавьте один миллилитр PBS, дополненный 2% FBS, чтобы промыть клетки и центрифугу в течение пяти минут через 1 575 G.To инициировать анализ проточной цитометрии, повторно суспендировать извлеченную гранулу в 200 микролитрах 1X PBS с 10% FBS, дополненной DAPI в растворе от 1 до 2000. Проанализируйте трубки в цитометре, используя параметры, описанные в текстовой рукописи.
Используйте график FSC-H и FSC-W для определения популяции синглетов. В синглетической фракции используйте график DAPI-A против FSC-A для определения жизнеспособной популяции клеток. С ранее закрытой DAPI-отрицательной популяцией используйте график APCA-A против FSC-A для определения CD45-положительной популяции.
Чтобы закрепить BM-подобную структуру, перенесите вставку со старой пластины на новую шестискважинную пластину, заполненную 1X PBS. Затем осторожно замените среду внутри вставки на 1X PBS. После того, как вставка будет промыта, поместите ее в новую шестилуночную пластину и заполните как колодец, так и вставку свежеоткрытым параформальдегидом.
Дайте процессу фиксации продолжаться в течение четырех часов при комнатной температуре, вдали от света. Затем вымойте вставку один раз с 1X PBS и храните ее на расстоянии четырех градусов Цельсия от света. После желаемого воздействия результаты показали, что можно поддерживать гематологические клетки в течение как минимум шести недель в 3D-модели, прежде чем извлекать жизнеспособные клетки.
Удалось заменить клеточную линию HS27A первичным нормальным MSC костного мозга или MSC острого миелоидного лейкоза в этой 3D BM-подобной модели или заменить кроветворную клеточную линию первичными ГСК. Парафин-встраивание и иммунохимия успешно позволили провести анализ содержимого CD45 и CD73 с использованием 3D-моделей. Эта 3D-система требует трех недель структур, подобных костному мозгу, и дополнительного времени с интересующими клетками.
И стерильные условия должны поддерживаться, так как иногда мы можем видеть загрязнение среды с изменениями среды два раза в неделю.
