В этом протоколе описывается генерация иммунной системы человека или мышей HIS для доклинических иммуноонкологических исследований. Модели рака мышей ограничены в своем разнообразии и плохо переносятся в клинику. Этот метод служит доклинической моделью для исследований иммунотерапии путем оценки лечения опухолей человека у мышей с иммунной системой человека.
Гуманизированная модель мыши может быть использована для изучения нескольких аспектов иммунологии человека, включая реакцию на многие инфекции или рак иммунной системы человека. Приобретение надежного и надежного источника пуповинной крови и поддержание здоровья колонии мышей с иммунодефицитом может быть сложной задачей. Опыт в области проточной цитометрии и иммунологического анализа имеет важное значение.
Продемонстрирует процедуру Кристина Ларсен, специалист по исследованиям из моей лаборатории. Для начала ресуспендируют CD34-положительную клеточную гранулу, выделенную из пуповинной крови, в 300 микролитрах буфера магнитного сепаратора клеток на 10 до восьмой клетки. Добавьте 100 микролитров реагента, блокирующего FCR, на один раз 10 в восьмую ячейку, затем 100 микролитров CD34-положительных магнитных шариков на 10 восьмых клеток и инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут.
Затем добавьте пять миллилитров буфера сепаратора магнитных ячеек по 10 раз в восьмую ячейку и вращайте при 360 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Повторите этап промывки и ресуспендируйте гранулы в 500 микролитрах на 100 миллионов ячеек буфера сепаратора магнитных ячеек в конической трубке объемом 15 миллилитров, меченной нефракционированной. Пометьте еще две 15-миллилитровые пробирки: CD34-отрицательный и CD34-положительный Поместите три пробирки на охлаждающую решетку.
Разделите ячейки с помощью двухколонной программы положительного отбора на автоматическом магнитном сепараторе ячеек в шкафу биобезопасности. Затем для расширения и замораживания CD34-положительных стволовых клеток человека готовят пуповинную кровь или CB-среду, как описано в рукописи, и пропускают через фильтр 0,22 микрона. Ресуспендируют CD34-положительные клетки при 100 000 на миллилитр среды CB и инкубируют при 37 градусах Цельсия.
На третий день добавьте в колбу равный объем среды CB без цитокинов. На пятый день соберите расширенные CD34-положительные клетки. Пипеткой суспензируйте ячейку вверх и вниз и соберите в 50-миллилитровую коническую трубку.
Добавьте достаточное количество CB medium, чтобы покрыть дно колбы. С помощью клеточного скребка соскребите все дно колбы. Соберите все носители в одну и ту же 50-миллилитровую пробирку и центрифугу.
Ресуспендируют клетки в двух миллилитрах среды CB и центрифуге. Аспирируйте среду вниз к грануле и ресуспендируйте гранулы в морозильной среде. Затем начните подготовку CD34-положительных клеток через три часа после облучения щенков.
Разогрейте 10 миллилитров CB в 50-миллилитровой пробирке. Извлеките один флакон in vitro расширенных и замороженных CD34-положительных клеток на каждые четыре-шесть щенков для инъекции. Быстро разморозьте при температуре от 50 до 55 градусов по Цельсию, пока не станет видно небольшое количество льда, и добавьте ячейки в нагретую среду CB.
Используйте один миллилитр среды для ополаскивания каждого флакона и вращайте клетки при 360 г в течение 12 минут при четырех градусах Цельсия. Тщательно аспирируйте среду. Ресуспендируйте гранулу в двух миллилитрах CB-среды и посчитайте ячейки.
Опять же, центрифугируют клетки, аспирируют среду и ресуспендируют гранулу в 100 микролитрах стерильного PBS на n плюс один щенок для инъекции, в результате чего получается от 250 000 до 450 000 CD34-положительных клеток на мышь. Для выделения PBMC из крови мыши смешайте гепарин крови, осторожно пипеткой вверх и вниз, и медленно наложите сверху 500 микролитров градиента плотности 1,077 грамма на миллилитр, стараясь не нарушить границу раздела. Центрифугируют пробирку по 1,220 г в течение 20 минут при комнатной температуре без перерывов.
Удалите как можно больше клеток из охристой оболочки с помощью пипетки объемом 200 микролитров и добавьте в новую 1,5-миллилитровую пробирку, содержащую 750 микролитров питательной среды. Центрифуга при 360 г в течение 11 минут. Аспирируйте среду до 50 микролитров и ресуспендируйте гранулу в 750 микролитров уборочной среды.
Получите данные для 100 микролитров каждого образца на проточном цитометре. Затем импортируйте файл fcs в программное обеспечение для редактирования данных потока и примените полигональный вентиль к графику FSC-A и SSC-A. Измените оси на FSC-A и FSC-H и расположите ячейки по линейной диагонали, исключив дублеты, выступающие из линии.
Выделите эти ячейки и измените оси на hCD45 против mCD45. Примените полигональные ворота к hCD45-положительной популяции и примените имя человека. Примените полигональные ворота к mCD45-положительной популяции и примените имя мыши.
Создайте статистику подсчета для популяций людей и мышей. Затем выберите человеческую популяцию и измените оси на CD19 против CD3. Примените полигональные ворота к CD19-положительным ячейкам и назовите их B-клетками.
Примените полигональные ворота к CD3-положительной популяции и назовите ее Т-клетками. Затем примените полигональные ворота к двойной отрицательной популяции и назовите ее не-ТБ. Выберите популяцию Т-клеток и измените оси на CD4 по сравнению с CD3.
Примените полигональные ворота к CD4-положительной популяции и назовите ее CD4-положительной. Примените полигональный вентиль к CD4-отрицательной популяции и назовите его CD8. Выберите популяцию, не страдающую туберкулезом, и измените оси на CD56 по сравнению с миелоидом.
Примените полигональные ворота к общей CD56-положительной популяции и назовите ее NK-клетками. Затем примените полигональные ворота к CD56-отрицательной и миелоид-положительной популяции и назовите ее миелоидной. Создайте таблицу для процентной статистики и статистики подсчета всех популяций и экспортируйте ее в электронную таблицу.
Рассчитайте процент химеризма hCD45 по указанной формуле. После выращивания опухолевых клеток у мыши и введения медикаментозного лечения собирают ткани. Поместите мышь на доску для рассечения пенопласта с булавками, чтобы удерживать их на месте, а руки и ноги вытянуть под углом 45 градусов.
Сделайте разрез по середине туловища, начиная с таза и доходя до подбородка. Подтяните кожу к краю, и удерживайте ее на месте булавками. Извлеките лимфатические узлы с помощью тонких щипцов в порядке подмышечных, шейных, брыжеечных, паховых и паховидных.
Поместите лимфатические узлы с одной стороны предметного стекла в чашку Петри в восемь миллилитров среды для сбора урожая. Держа предметные стекла под перпендикулярными углами матовыми краями внутрь, аккуратно прижимайте ткани до тех пор, пока клеточное содержимое не освободится. Промойте предметное стекло несколько раз, раздвинув их и вместе, чтобы освободить максимальное количество ячеек.
Соберите клетки с помощью пятидюймовой стеклянной пипетки и отфильтруйте их через девятидюймовую ватную пипетку в маркированную 15-миллилитровую коническую трубку. Затем извлеките опухоль из открытого бока, удерживая опухоль щипцами, медленно разрезая края опухоли ножницами для рассечения. Взвесьте опухоль и удалите 1/4 опухоли для обработки РНК и иммуногистохимии.
Поместите оставшиеся 3/4 опухоли в шестисантиметровую посуду и измельчите ее на кусочки размером в один миллиметр с помощью лезвия скальпеля. Перенесите кусочки опухоли в диссоциативную трубку. Затем промойте посуду неполной средой TIL и добавьте ее в тюбик.
Добавьте препарат коллагеназы и диссоциируйте ткань с помощью механической диссоциации при 37 градусах Цельсия в течение от 30 минут до одного часа. Пропустите суспензию над фильтром толщиной 100 микрон в коническую трубку объемом 50 миллилитров и промойте фильтр 10 миллилитрами фильтрующего материала TIL. Центрифугируйте и ресуспендируйте гранулы в достаточно питательной среде с ДНКазой, чтобы суспензия клеток могла легко пройти через наконечник пипетки P1000 и записать объем для последующего анализа.
В PDX CRC 307P комбинированное лечение замедляло рост опухоли, что определялось объемами роста опухоли с течением времени, весом опухоли и удельной скоростью роста. PDX CRC 307M, протестированный в другой когорте мышей, был менее затронут тем же комбинированным лечением у мышей HIS BRGS. Основываясь на общем hCD45-положительном и человеческом Т-клеточном hCD3-положительном химеризме в крови до имплантации опухоли, оба параметра увеличивались в периферической иммунной системе и TIL в сочетании с обработанными мышами, несущими CRC 307P, но не с моделью CRC 307M.
Исследование Т-клеток человека выявило больше активированных Т-клеток в опухолях CRC 307P, но не лимфы у мышей, получавших комбинированную обработку. Кроме того, было больше эффекторных CD8-положительных Т-клеток памяти и меньше TIM-3-положительных Т-клеток в комбинированных опухолях CRC 307P. Напротив, эта разница не была отмечена в модели CRC 307M.
Кроме того, никаких изменений в частотах цитотоксических популяций Т-клеток не наблюдалось среди мышей, получавших комбинированную терапию, хотя более высокие цитотоксические Т-клетки наблюдались у необработанных. Комбинированное лечение не влияло на частоту Tregs ни в лимфатических органах CRC 307P, ни в опухолях, хотя данные CRC 307M показали тенденцию к снижению Tregs. Иммунные изменения в опухолевых клетках были повышены с помощью проточной цитометрии.
Повышенная экспрессия MHC класса I и класса II наблюдалась на опухолевых клетках CRC 307P, вырезанных у мышей HIS BRGS, обработанных комбинированным лечением. В модели CRC 307M то же лекарственное лечение индуцировало экспрессию HLA класса II на опухолевых клетках. Аналогичным образом, комбинированное лечение привело к увеличению экспрессии PD-L1 на EpCAM-положительных опухолевых клетках CRC 307P.
Наконец, были исследованы корреляции иммунных реакций с опухолевым ростом. Увеличение CD4-положительных Т-клеток показало значительную корреляцию с меньшим ростом опухоли и, в частности, с HLA-DR-положительными активированными Т-клетками в комбинации, обработанной мышами HIS. Стерильный метод при выделении CD34-положительных клеток, так как мыши крайне иммунодефицитны.
Результирующий химеризм варьирует внутри и между донорами пуповинной крови, и Т-клетки имеют наибольшие вариации. Могут быть выполнены неограниченные комбинации иммунотерапии, а также механистические и кинетические исследования дозирования лекарств, например, делеция CD8 Т-клеток для подтверждения их роли. Важно отметить, что токсичность, связанная с наркотиками, также может быть изучена.
Он предоставил более актуальную и доступную доклиническую модель для тестирования иммунотерапии человека для трансляции в клинику. На основе этих данных в настоящее время проводится несколько клинических испытаний.
