Этот протокол важен, потому что он упрощает и позволяет измерять яркость в толстых материалах, позволяя нам собирать важную информацию при изучении живых систем. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет проводить спектральные измерения с пространственным разрешением в высокопоглощающих материалах с использованием оборудования, которое может быть построено, и экспериментов, которые могут проводиться в полевых лабораториях. Этот метод может быть адаптирован и применен к любой живой системе.
Техника изготовления зондов имеет нюансы, но практика ведет к совершенству. Отрегулируйте технику измерения в зависимости от исследуемого материала и внесите изменения, которые приведут к более безопасному положению ткани и меньшему трению зонда. Для начала соберите стеклянную втулку с помощью 5,75-дюймовой пипетки Пастера.
Используя монтируемый зажим типа «крокодил», установите стеклянную пипетку за широкий конец так, чтобы конический конец был обращен вниз к полу, а ориентация пипетки была перпендикулярна полу. Поместите прокладку изоленты на 50-граммовую пластиковую рукоятку для тисков, чтобы предотвратить соскальзывание, и повесьте тиски на конический конец пипетки. Используя небольшую бутановую горелку, нагрейте конический конец пипетки, как описано в рукописи.
Когда длина пипетки увеличится примерно на пять дюймов, немедленно удалите пламя. Затем маленькими ножницами или стеклорезом обрежьте вытянутый конец пипетки. Подпилите все острые участки обрезанного конца карборундовой бумагой и смойте мельчайшие осколки стекла или пыль изопропиловым спиртом, а затем сжатым воздухом.
Используйте лезвие бритвы, чтобы разорвать оптическое волокно и удалить один разъем SMA оптического волокна с окончанием SMA. Убедитесь, что вы разрезаете близко к одному из окончаний SMA. Затем снимите следующие пять сантиметров пластиковой и стекловолоконной оболочки так, чтобы оголенное оптическое волокно обнажилось и выступало из остальной части всей сборки.
Используйте бутановую горелку, чтобы сжечь полиамидное полимерное покрытие из стекловолокна. Смойте изопропанолом и протрите голое стекловолокно безворсовой салфеткой. Теперь установите оголенный конец оптического волокна непосредственно в зажим плоскогубцев на краю стола или полки, позволяя концу волокна с концевыми концами SMA свисать к полу.
Примерно в четырех-шести дюймах от того места, где оголенное оптическое волокно удерживается в зажиме плоскогубцев, добавьте грузы для вытягивания с помощью двух небольших зажимов на конце волокна в оболочке. Чтобы вытянуть волокно, начните с включенного пламени бутановой горелки. Держите бутановую горелку на расстоянии одного сантиметра от оголенного волокна, как описано в рукописи.
И позвольте волокну растянуться, потянуться, отделиться и упасть на пол. Проверьте волокно под микроскопом и при необходимости обрежьте конец волокна небольшими ножницами для рассечения. Используйте непрозрачную ручку из пенопласта, чтобы затемнить стороны волокна и предотвратить попадание рассеянного света.
Осторожно проведите кончиком ручки по волокну, оставив открытым только небольшой участок на кончике. Под стереомикроскопом осторожно вставьте коническое оптическое волокно в широкий конец измененной стеклянной пипетки и протолкните волокно до тех пор, пока из конического конца пипетки не будет торчать примерно один миллиметр голого волокна. С помощью изоленты прикрепите конец оптического волокна с оболочкой к широкому концу пипетки.
Нанесите каплю цианоакрилатного клея на иглу небольшого калибра. Осторожно прикоснитесь каплей клея к срезанному краю вытянутой пипетки, избегая оголенного конца вытянутого волокна. Чтобы модифицировать наконечник волокна с помощью рассеивающей сферы, создайте сырье, смешав каплю УФ-отверждаемого клея с порошком диоксида титана в равном соотношении.
Прикрепите зонд к микроманипулятору с помощью держателя крепежного стержня так, чтобы зонд находился в горизонтальной ориентации. Подготовьте рабочий резервуар рассеивающего материала, окунув кончик проволоки или иглы в приготовленную смесь так, чтобы образовалась капелька клея. Закрепите проволоку или иглу каплей рядом с кончиком горизонтального зонда.
Нанесите рассеивающую сферу на кончик зонда. С помощью микроманипулятора медленно и осторожно вдавите наконечник оптического волокна зонда в приготовленную смесь. Затем быстро вынимал наконечник из клея и рассматривал рассеивающий шарик в микроскоп.
Повторяйте до тех пор, пока сферическая капля клея нужного размера не наложится на кончик оптического волокна. Подготовьте посуду для монтажа образцов. Используя бутановую горелку, нагрейте большой конец пипетки Пастера, чтобы расплавить отверстие диаметром 0,5 сантиметра в дне пластиковой чашки Петри.
Заклейте отверстие на нижней стороне посуды изолентой или лабораторной лентой. Затем заполните одну чашку Петри на четверть пути, а вторую чашку Петри до конца жидким желатином и дайте ему остыть до комнатной температуры, чуть меньше гелеобразования. В одной посуде поместите биопсию в подушку из вязкого желатина, который образовался в отверстии на дне чашки.
Используя пипетку Пастера, аккуратно добавьте желатин комнатной температуры вокруг биопсии, пока чашка Петри не заполнится. Для заготовки образца используйте блюдо, наполненное только желатином. Прикрепите зонд к вертикально ориентированному креплению так, чтобы оно было направлено на источник света, и закрепите зонд хомутами, хомутами для шлангов или лентой на стойке оптического стола.
Подключите конец оптического волокна зонда с концевой станцией SMA к оптоволоконному спектрометру USB и подключите спектрометр к компьютеру с помощью USB-кабеля. Держите зонд и манипуляторы в точно выровненном положении, где будут собираться данные. Используйте ватный тампон, иглу тонкого калибра или капельницу, чтобы осторожно нанести небольшое количество силиконовой смазки на ту часть зонда, которая будет вставлена в ткань, чтобы уменьшить трение между сторонами зонда и образцом ткани.
Теперь снимите ленту, закрывающую отверстие в чашке Петри для образцов, и поместите ее в держатель образца, убедившись, что она надежно удерживается на месте трением. С помощью микроманипулятора опустите образец на зонд и позвольте зонду войти в желатин через отверстие на нижней стороне чашки Петри. Продолжайте до тех пор, пока зонд не окажется примерно в пяти миллиметрах от дна желатинового слоя.
Включите источник света. Используя программное обеспечение спектрометра, отрегулируйте время интеграции спектрометра до тех пор, пока сигнал не станет как можно выше, но не насыщающим. Установите среднее количество сканирований от двух до пяти, а значение пикселов сглаживания — шесть.
Полезное время интеграции на этом этапе может варьироваться от одной до 15 миллисекунд для этого базового уровня. Убедитесь, что время интегрирования соответствует измерению, убедившись, что спектр не является ни слишком шумным, ни насыщенным. При необходимости измените время интеграции.
Переместите образец на указанное расстояние с помощью микроманипулятора и выполните измерения. Продолжайте сохранять спектры в каждом вертикальном положении внутри ткани. Визуализируется микроскопический вид зонда, проходящего через ткань.
Показан процент света на разной глубине ткани относительно исходного уровня. Самое важное, что нужно помнить, это то, что эти зонды хрупкие, поэтому не торопитесь и убедитесь, что соединения зондов надежно закреплены, прежде чем продолжить. После изготовления зонда методы измерения могут быть адаптированы.
Например, без рассеивающего шара зонды можно использовать для измерения яркости, достигающей детектора с одного направления. После разработки этого зонда исследователи смогли измерить свет внутри мозга и жировой ткани у мышей, используя вариацию нашего измерительного прибора. Это помогло ответить на вопрос о том, достаточно ли света для активации фоторецепторов, присутствующих глубоко внутри ткани.
