Этот протокол позволяет точно определить продолжительность S-фазы в синхронизированных почковых дрожжевых клетках. Это быстрый, простой и воспроизводимый метод. Кроме того, он достаточно чувствителен, чтобы обнаружить легкие дефекты синтеза, не обнаруженные классическими протоколами.
Этот метод будет полезен для многих исследователей, работающих над регуляцией клеточного цикла в почковых дрожжах. Продемонстрировать этот протокол будут Николас Таларек, старший научный сотрудник, и Хуан Де Диос Барба Тена, аспирант в лаборатории. Инокулируют клетки Saccharomyces cerevisiae в 10 миллилитрах среды SC при низкой концентрации клеток для ночной культуры при 30 градусах Цельсия с орбитальным возбуждением при 130 оборотах в минуту.
На следующий день разводят клетки в 20 миллилитрах свежей среды SC в конечной концентрации от двух до трех раз от 10 до шести клеток на миллилитр. При 40 микролитрах по одному миллиграмму на миллилитр альфа-фактор разводят в воде. Затем культивируйте клетки при 30 градусах Цельсия, с орбитальным перемешиванием со скоростью 130 оборотов в минуту в течение одного часа.
Повторите этот шаг один раз. Визуализируйте клетки под световым микроскопом для мониторинга остановки G1. Продолжайте, если более 90% ячеек отображают shmoo, а остальные представляют собой округлые размыкаемые ячейки.
Центрифугируйте образцы в течение трех минут при 1 500 г. Затем выбросьте супернатант с помощью вакуумной пипетки и повторно суспендируйте ячейки в 20 миллилитрах среды SC. Повторите этот шаг один раз. Соберите один миллилитр клеток дважды каждые пять минут и приступайте к маркировке EDU.
Добавьте 400 микролитров альфа-фактора через 30 минут после высвобождения. Переведите один миллилитр клеточной культуры в двухмиллилитровую микрофьюжную трубку, содержащую один микролитр 10 миллимоляров EDU, хорошо перемешанную путем инверсии. Чтобы отличить EDU-положительные клетки от EDU-отрицательных клеток по бивариантным фактам Pi EDU, переведите еще один миллилитр клеточной культуры в двухмиллилитровую микрофьюжную трубку, содержащую один микролитр DMSO.
Инкубировать в течение трех-пяти минут при температуре 30 градусов Цельсия при перемешивании на встряхивающей водяной бане. Остановите реакцию, добавив 100 микролитров 100% этанола. Гранулируют клетки в течение двух минут по 10 000 г в микрофуге.
Удалите супернатант с помощью вакуумной пипетки. Повторно суспендируйте ячейку гранулы в 500 микролитров 70% этанола и хорошо перемешайте путем вихря. Оставьте образцы при комнатной температуре в течение по меньшей мере одного часа при 20 наклонах в минуту на коромысле с переменной скоростью для пермеализации клеток.
Гранулируйте ячейки в течение двух минут при 10 000 Г в микроцентрифуге и выбрасывайте супернатант вакуумной пипеткой. Дважды промыть клетки 500 микролитрами 10% этанола и PBS. Гранулируйте клетки в течение двух минут по 10 000 г в микрофрагме и выбрасывайте супернатант вакуумной пипеткой.
Повторно суспендируют гранулы в 200 микролитров ПБС, содержащих РНКазу А и протеиназу К. Инкубируют от одного до двух часов при 50 градусах Цельсия со случайным встряхиванием или на ночь при 37 градусах Цельсия. Гранулируйте ячейки в течение двух минут при 10 000 Г в микроцентрифуге и выбрасывайте супернатант вакуумной пипеткой. Промыть ячейки 500 микролитрами PBS.
Затем гранулируют клетки и отбрасывают супернатант, как было показано ранее. Повторное суспендирование клеточной гранулы в 200 микролитров PBS с 1% BSA. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре.
Затем гранулируют клетки, отбрасывают супернатант, как показано ранее, и повторно суспендируют гранулу в 300 микролитрах PBS, содержащих 1% BSA. Распределите ячейки на две микроцентрифужные трубки по 1,5 миллилитра. Первая должна состоять из 200 микролитров клеточной культуры для реакции Клика, а вторая трубка должна содержать 100 микролитров клеточной культуры для окрашивания ситокс-зеленым цветом.
Затем гранулируйте клетки и выбросьте супернатант, как было показано ранее. Для окрашивания ситокс-зеленым цветом повторно суспендируйте ячейку гранулы в 100 микролитрах PBS. Затем, в зависимости от концентрации в клетке, переложите от 10 до 30 микролитров в проточную трубку цитометра, содержащую 300 микролитров зеленой смеси ситокса.
Обрабатывайте образцы ультразвуком дважды в течение двух секунд с амплитудой от 40 до 50%, оставьте в темноте до обработки образцов на проточном цитометре. Для реакции Click повторно суспендируйте гранулу ячейки 40 микролитрами свежеприготовленного буфера красителя Азида. Инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 60 минут.
Гранулируйте клетки и выбрасывайте супернатант, как показано ранее. Затем промыть клетки три раза 300 микролитрами 10% этанола в PBS. Затем повторно суспендируют клетки в 100 микролитрах по 50 мкг на миллилитр пропидия йодида в PBS и оставляют на 10 минут в темноте.
В зависимости от концентрации в клетке переносят от 10 до 30 микролитров клеточной суспензии в проточную трубку цитометра, содержащую 300 микролитров 50 миллимоляров Tris HCl, рН 7,5. Соник дважды в течение двух секунд при амплитуде от 40 до 50. Оставьте образцы в темноте до обработки их на цитометре.
Считывайте зеленые образцы ситокса с помощью синего лазера возбуждения на расстоянии 488 нанометров и полосового фильтра 530 на 30. Считывайте образцы Bavaria Pi EDU на точечном графике с помощью синего лазера возбуждения на 488 нанометрах и фильтра 615 на 20 полос для оси Pi X, а также красного лазера возбуждения на 640 нанометрах, фильтра 660 на 20 полос для оси Y. Три популяции клеток наблюдались в бивариантном анализе цитометра EDU Pi.
При 25 градусах Цельсия примерно 27% клеточной популяции находилось в фазе G1, 29% было в фазе S и около 44% было в фазе G2 плюс M. В синхронизированных клетках продолжительность S-фазы может составлять около 25 минут в зависимости от времени, когда содержание ДНК изменилось от одного С до двух С на профиле цитометра зеленого потока ситокса. Маркировка импульсов EDU точно определяла длительность S-фазы.
Через 15 минут после высвобождения была обнаружена часть EDU-положительных клеток, что указывает на начало S-фазы. Прогрессирование через S-фазу было видно по облаку клеток, движущемуся вверх и вправо на графике Bavaria Pi EDU. Наконец, через 35 минут после высвобождения часть клеток была EDU-отрицательной, но с удвоенным количеством ДНК, указывающим на то, что S-фаза закончилась, и клетки находились в фазе G2 плюс M.
Несмотря на наблюдаемую высокую синхронность, некоторые клетки заканчивали S-фазу через 60 минут после высвобождения, а S-фаза была завершена для всей популяции примерно через 65 минут после высвобождения. Крайне важно иметь идеальную синхронизацию и предотвращать вхождение клеток во вторую S-фазу. Клетки могут быть визуализированы с помощью микроскопа, где можно контролировать и количественно оценивать предвидение репликации ядерной ДНК.
Этот метод поможет выявить неуглядных мутантов, которые имеют легкие дефекты S-фазы, а также дефекты длительности клеточного цикла.
