dd-PCR является высокочувствительным и точным методом абсолютной количественной оценки целевой ДНК или РНК. Он был использован для диагностики заболеваний, где другие традиционные методы не дают точных результатов. dd-PCR является наиболее чувствительным методом обнаружения очень низких обильных молекул нуклеиновых кислот.
В отличие от количественной ПЦР, dd-PCR не требует какого-либо контроля генов для количественной оценки. Благодаря своей чувствительности и точности, dd-PCR может использоваться в качестве инструмента для молекулярной диагностики и исследований с участием молекул РНК с низким содержанием, таких как микроРНК и круговые РНК. Перед использованием dd-PCR следует выполнить ОТ-ПЦР или ОТ-qPCR, чтобы подтвердить, что праймеры амплируют свои гены-мишени без какой-либо неспецифической амплификации ПЦР.
Для начала подготовьте шаблонную последовательность ПЦР длиной 200 нуклеотидов, соединив последние 100 нуклеотидов общей длины круговой последовательности РНК с первыми 100 нуклеотидами круговой последовательности РНК. Используйте шаблонную последовательность для праймера, разработанную веб-инструментом Primer 3. Возьмите одну 10-сантиметровую чашку, содержащую около 5 миллионов пролиферирующих клеток миобластов C2C12 и одну четырехдневную дифференцированную миотубу C2C12 для выделения РНК.
Вымойте ячейки 10 миллилитрами 1X PBS три раза и выбросьте PBS с помощью пипетки. Добавьте один миллилитр реагента изоляции РНК и лизируйте клетки путем энергичного пипетирования. Затем добавьте 200 микролитров хлороформа и вихря в течение 15 секунд.
Центрифугируйте трубку при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут при 12 000 г. Возьмите 400 микролитров верхнего водного слоя, загрузите ее на столб кремнезема и центрифугу в течение одной минуты при 12 000 г при комнатной температуре. Проведите поток в новую трубку и добавьте 600 микролитров 100% этанола. Добавьте 20 микролитров магнитных шариков кремнезема и поместите трубку на термомикшер, установленный при 25 градусах Цельсия и 1 200 оборотах в минуту в течение пяти минут.
Затем поместите трубку на магнитную подставку на 30 секунд или до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Повторное суспендирование магнитных шариков кремнезема в 500 микролитрах промывочного буфера, содержащего 90% этанола. Поместив трубку на магнитную подставку на 30 секунд, дайте шарикам осесть к магниту и выбросьте буфер с помощью пипетки.
Высушите трубку на воздухе при температуре 50 градусов Цельсия в течение трех минут на термомикшере, держа крышку открытой. Добавьте 20 микролитров воды без нуклеазы и повторно суспендируйте шарики. Соберите растворенную РНК в новую трубку для оценки количества и качества с помощью спектрофотометра.
Измерьте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра и возьмите один микрограмм РНК для синтеза кДНК. Смешайте один микрограмм общей РНК с одним микролитром смеси dNTP, четырьмя микролитрами буфера 5X обратной транскриптазы, двумя микролитрами 10X обратного транскриптазного случайного праймера, 0,25 микролитра фермента обратной транскриптазы и 0,5 микролитра ингибитора РНКазы. Восполните объем до 20 микролитров, используя воду без нуклеазы.
Поместите трубку при 25 градусах Цельсия на 10 минут, а затем 50 градусов Цельсия в течение одного часа. Затем поместите трубку при 85 градусах Цельсия в течение пяти минут, чтобы инактивировать фермент. Настройте реакцию ПЦР 22 микролитров в 0,2-миллилитровых ПЦР-трубках или полосках, а также отрицательную контрольную трубку и нешаблонные контрольные трубки.
Добавьте 11 микролитров мастер-смеси dd-PCR, 5,5 микролитра циркулярной РНК-специфической прямой и обратной праймерной смеси одной микромолярной концентрации и 5,5 микролитра воды без нуклеазы для создания реакционных трубок NTC. Аналогичным образом, чтобы настроить пробирки, добавьте 11 микролитров мастер-смеси dd-PCR, 5,5 микролитра круговой РНК-специфической прямой и обратной праймерной смеси одной микромолярной концентрации и 5,5 микролитра кДНК. Для генерации капель перенесите 20 микролитров ПЦР-смеси из 0,2-миллилитровых ПЦР-пробирок в пробоотборники картриджа генератора капель.
Добавьте 70 микролитров масла для генерации капель в нефтяные скважины картриджа генератора капель осторожно, используя пипетку. Накройте картридж генератора капель резиновой прокладкой и поместите его в машину генератора капель, чтобы получить образец смеси капель масла, образующийся в капельных колодцах картриджа. Для амплификации ПЦР перенесите 40 микролитров смеси капель образца масла из капельных колодцев картриджа генератора капель на 96-луночную ПЦР-пластину с помощью пипетки.
Запечатайте 96-луночную ПЦР-пластину с помощью герметика из алюминиевой фольги. Поместите его в блок пластинчатого герметика, предварительно нагретый при 180 градусах Цельсия, и нажмите на уплотнение для герметизации пластины ПЦР. Затем поместите пластину в термоциклер dd-PCR и установите температуру крышки на 105 градусов Цельсия и скорость рампы до двух градусов Цельсия в секунду.
После того, как ПЦР закончится, поместите пластину на аппарат для счетчика капель dd-PCR с держателем пластины в правильном положении для подсчета капель. Откройте программное обеспечение для анализа капель и настройте запуск, введя информацию образца. Нажмите кнопку анализа, чтобы проанализировать данные после завершения считывания капель.
Затем нажмите кнопку 1D Amplitude, чтобы увидеть положительные и отрицательные капли. Чтобы отделить положительные капли от отрицательных капель, поставьте общую пороговую линию для всех образцов с одной и той же мишенью. Нажмите кнопку экспорта, чтобы экспортировать данные круговой РНК в виде CSV-файла.
Экспортированные данные показывают количество круговых РНК, присутствующих в каждом образце. Вручную рассчитайте количество круговых РНК в каждом образце на нанограмм РНК, учитывая общее количество кДНК, используемой в каждой реакции. Анализ данных с помощью программного обеспечения QuantaSoft показан здесь.
Все образцы, кроме MT1, показали более 12 000 капель. Поскольку общее количество капель в МТ1 было низким, эта выборка не рассматривалась для окончательного анализа данных. Интересно, что наблюдалась явная разница в структуре экспрессии Circ B и C2 в четырехдневном дифференцированном состоянии миотруб по сравнению с клетками миобластов.
Анализ обилия Circ B и C2 с точки зрения числа копий показал, что три реплики миобластов C2C12 имели 76,8, 67 и 46 копий на нанограмм РНК, в то время как два образца миотрубок имели 558 и 610 копий на нанограмм РНК. Данные в гистограмме представляют собой среднее плюс минус стандартное отклонение от двух до трех биологических реплик. ddPCR является одним из самых передовых методов измерения точной дифференциальной экспрессии целевой круговой РНК.
Этот метод станет важным инструментом для ускорения исследований и диагностики циркулярной РНК в следующем году.
