Извлечение люмикана из амниотической мембраны и определение температуры ее хранения

Этот метод направлен на демонстрацию простой техники экстракции белка, полезной для получения обильных белков и других факторов. Этот метод может быть использован для извлечения других факторов и белков, присутствующих в амниотической мембране, а также для получения белков из других источников, таких как животные и растительные ткани. Начинают с размораживания 100 миллиграммов амниотической мембраны, полученной из банка амнионов.

После размораживания добавьте 10 миллилитров стерильного сбалансированного солевого раствора в чашку Петри и промойте мембрану в течение двух минут. Затем удалите использованный сбалансированный раствор соли в стакан и повторяйте процесс до тех пор, пока в чашке Петри не будет видно следов глицериновой среды. Затем добавьте 10 миллилитров диспазы II к мембране и инкубируйте при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 30 минут.

В конце инкубации выполните механическую деэпителизацию с помощью резинового скребка для клеток полицейского. Затем визуализируйте мембрану под инвертированным микроскопом, чтобы подтвердить деэпителизацию. Затем промыть деэпителиализованную амниотическую мембрану стерильным сбалансированным солевым раствором, как показано ранее, и поместить ее в двухмиллилитровую микроцентрифужную трубку.

Затем погрузите трубку, содержащую мембрану, в жидкий азот на 40 минут. После замораживания жидким азотом вручную измельчите мембрану в течение двух-трех минут в растворе, предварительно охлажденном при минус 85 градусах Цельсия, до получения мелкодисперсного порошка. Далее добавляют 2,5 миллилитра раствора ингибитора протеазы и солюбилизируют мелкопорошковую мембрану.

Очистите стенки раствора с помощью скальпельного ножа и перенесите смесь в пятимиллилитровую трубку. Вихрь трубки в течение 30 секунд. Затем гомогенизируют тканевую смесь, сначала центрифугируя при 34 г в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия, и сразу же центрифугируя ее снова при 3, 360 г в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия.

В конце центрифугирования соберите супернатант, который является экстрактом амниотической мембраны, в новую трубку. Затем аликвот 0,7 миллилитров в другой двухмиллилитровой микроцентрифужной трубке для различных временных точек и температур. Общее количество белка и концентрация люмикана в экстракте амниотической мембраны зависели от времени и условий хранения.

Концентрация базального белка была одинаковой среди всех экстрактов амниотической мембраны. Однако значительно высокая концентрация белка была отмечена в экстракте, хранящемся в течение 32 дней при четырех градусах Цельсия и 20 дней при минус 20 градусах Цельсия. Люмикан в экстракте амниотической мембраны был значительно выше в образце, хранящемся в течение 12 дней, по сравнению с образцами, хранящимися в течение 30, 20 и шести дней при четырех и минус 20 градусах Цельсия.

Эти результаты показали, что соответствующее время хранения и температура для достижения самой высокой концентрации люмикана составляет 12 дней при минус 20 градусах Цельсия. Проявляйте максимальную осторожность при заземлении замерзшей амниотической оболочки. Заземление должно быть мягким, так как оно может выпасть из раствора.

Необходимы дальнейшие исследования для определения роли люмикана экстракта амниотической мембраны в эпителиальных клетках роговицы и определения идеальной дозы люмикана для реэпителизации роговицы.