Каспазы – это цистеиновые протеазы, которые расщепляют субстраты во время апоптоза и неапоптотических процессов. Этот протокол описывает анализ расщепления in vitro для идентификации предполагаемых субстратов инициатора каспазы Dronc из дрозофилы. При тщательном соблюдении этот протокол обеспечивает надежную процедуру высокопроизводительного скрининга предполагаемых субстратов каспазы Dronc или любой другой каспазы.
Хотя этот протокол был разработан для анализов расщепления in vitro с использованием Drosophila caspase Dronc, он может быть легко адаптирован для каспаз других организмов, включая млекопитающих. Важно, чтобы очистка рекомбинантных каспаз и анализы расщепления in vitro проводились в один и тот же день, поскольку эти препараты каспазы быстро теряют ферментативную активность. Продемонстрировать процедуру будет доктор Пратхибха Ярикипати, постдокторант из моей лаборатории.
Для начала снимите замороженные пробирки с гранулированными культурами из хранилища минус 80 градусов цельсия и подержите их на льду в течение 10 минут, чтобы смягчить гранулу. Через 10 минут добавьте 0,6 миллилитра буфера лизиса бактериальных клеток, дополненного свеженазначенными ингибиторами протеазы, 10 миллиграммов на миллилитр лизоцима и 50 единиц на миллилитр бензоназы, в гранулы, содержащие трубки, используя контроллер пипетки с одной миллилитровой серологической пипеткой. С тем же наконечником пипетки растворите гранулу, пипеткой вверх и вниз, пока не будет виден прозрачный, бледно-желтый раствор, без каких-либо частиц гранул, и инкубируйте в течение 30 минут на льду.
Переложите лизаты в соответствующие центрифужные трубки и центрифугируйте их при 17 000 G в течение 40 минут при 4 градусах Цельсия. Перенесите супернатанты в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку, которая представляет собой сырой экстракт, содержащий каспазы, и держите трубки на льду. Добавьте 0,2 миллилитра 50% суспензии агарозы нитрилоуксусной кислоты в каждую трубку экстрактов каспазы и вращайте трубки на сквозном ротаторе в течение одного часа при 4 градусах Цельсия.
Через час добавьте экстракт с агарозой нитрилоуксусной кислоты в один миллилитр полипропиленовых столбиков с неповрежденным наконечником, поместите в стойку и дайте ему постоять в течение пяти минут, чтобы дать агарозе нитрилоуксусной кислоты осесть. Через пять минут снимите крышку колонн и дайте супернатанту вытечь гравитационным потоком. Затем аккуратно добавьте один миллилитр промывочного буфера в колонны, не нарушая упакованную смолу агарозы нитрилоуксусной кислоты, и промыть ее через гравитационный поток.
Для элюирования каспаз поместите 1,5-миллилитровые микроцентрифужные трубки под сопло коллекторных колонн, после полного слива промывочного буфера. Затем добавьте 0,5 миллилитра буфера элюирования в каждую колонку и соберите элюант в 1,5-миллилитровые микроцентрифужные трубки. Держите элюанты на льду и измеряйте концентрацию белков с помощью анализа Брэдфорда.
В зависимости от уровня экспрессии предполагаемого субстрата, используйте от 1 до 10 микролитров лизата ретикулоцитов кролика, запрограммированного с интересующим белком в анализе расщепления, и держите его на льду. Добавьте 10 микрограмм очищенного белка каспазы, полученного ранее, и доведите общий объем реакции до 50 микролитров с буфером анализа каспазы. Инкубируйте реакции на водяной бане при температуре 30 градусов Цельсия в течение трех часов, обеспечивая включение соответствующих элементов управления в анализ расщепления.
Через три часа остановите реакции, перенеся трубки на лед, и добавьте один объем буфера образцов LDS, содержащего 50 миллимоляров DTT. Инкубируйте образцы при температуре 75 градусов Цельсия в тепловом блоке в течение 10 минут. Быстро вращайте, смешивайте путем щелчка, загружайте 24 микролитра на образец и запускайте страницу SDS или храните образцы при минус 20 градусах Цельсия.
Четыре различные рекомбинантные каспазы были индуцированы, очищены и проанализированы SDS-PAGE, иммуноблоттированы, и пятно было исследовано антигистидиновым антителом. Необработанный 6x-гистидин Dronc работает с относительной молекулярной массой 55 килодалтонов, а необработанный 6x-His DRICE имеет молекулярную массу 35 килодалтонов. Автоматическая обработка каспаз видна по появлению полос меньшей молекулярной массы.
Для расщепленного Дронка это полоса в 40 килодалтон. Для расщепленного Дриса это полоса в 23 килодалтоны. После реакции расщепления in vitro белки были разделены SDS-PAGE, иммуноблоттированы, и пятна инкубировались с антимиковым антителом для обнаружения амино-терминально меченого Myc Drice C211A.
Результаты показали, что бактериально продуцируемый и очищенный 6x-гистидин Dronc препарат дикого типа обладает ферментативной активностью. Это видно по наличию меньшей полосы расщепленного Дриса по сравнению с неочищенным проДрисом. Реакция расщепления in vitro, в которой используется как рекомбинантная каспаза, так и субстрат, была проанализирована с помощью SDS-PAGE и иммуноблота.
Для анализа реакции расщепления в этом иммуноблоте использовалось антирасщепленное антитело Drice. Результаты показали, что бактериально-продуцируемый и очищенный препарат 6x-His Dronc обладает ферментативной активностью. Это видно по наличию меньшей полосы расщепленного Дриса по сравнению с неочищенным проДрисом.
Пожалуйста, помните, что рекомбинантные каспазы быстро теряют ферментативную активность. Их нельзя хранить, даже при минус 80 градусах Цельсия. Анализ расщепления in vitro должен быть выполнен в тот же день.
Положительные попадания в анализ расщепления in vitro должны быть подтверждены in vivo. Это может быть сделано в клетках или в генетических модельных организмах, таких как Drosophila или C.elegans.
