Этот протокол закрывает значительный разрыв между естественной эволюцией вирусов и их использованием в качестве рекомбинантных векторов для генной терапии человека, обеспечивая их инженерию, диверсификацию и стратификацию. Этот метод позволяет проводить высокопроизводительный параллельный скрининг новых, изолированных или сконструированных аденоассоциированных вирусов, короче говоря, вариантов AAV, тем самым экономя количество животных, работу, затраты и время. Идентифицированные варианты капсида AVV могут повысить эффективность и специфичность доставки терапевтических трансгенов на основе AAV, тем самым снижая требуемую дозу вируса.
Это может повысить безопасность и применимость генной терапии. Тот же подход может быть также использован для капсидной или промоторной инженерии других средств доставки генов, что улучшает наше понимание их биологии и их использования в генной терапии. Продемонстрировать процедуру помогут аспиранты Йонас Беккер и Цзиссинь Лю, постдок Джоанна Шумска и Маргарита Заяс, а также научные сотрудники Эмма Герстманн и Эллен Видтке из моей лаборатории.
Начните с анализа данных секвенирования NGS с помощью Python 3 и Biopython. Анализ NGS состоит из двух этапов. На первом шаге выполните поиск в файлах последовательностей последовательностей, удовлетворяющих определенным критериям, таким как фланкирующие последовательности, длина и расположение, с помощью первого сценария, а также файла конфигурации, предоставляющего необходимые сведения.
На втором шаге преобразуйте извлеченные последовательности, начиная с последовательности AGWGGC, используя сценарий номер два, а также конфигурацию и zuordnung. txt-файлы, предоставляющие необходимую информацию. Подготовьте две папки: сценарий и данные.
Скопируйте сжатые файлы Gzip, полученные в результате виртуализации, в папку данных. Затем скопируйте Python и конфигурационные файлы в папку скрипта, как описано в текстовой рукописи. Перед запуском скриптов откройте zuordnung.
txt и добавьте два столбца, разделенных табуляцией. Введите имена файлов Gzip в первом столбце и желаемое окончательное имя во втором столбце. Измените переменные в конфигурационном файле, как описано в текстовой рукописи.
Используя специальную команду, инициируйте обнаружение и извлечение последовательности вариантов. На выходе будут файлы TXT с извлеченными последовательностями ДНК и их номерами считываний. Заголовок этого файла содержит статистические данные, и эти данные будут перенесены в следующие файлы.
Эти данные TXT будут входным файлом для сценария номер два, в котором последовательности ДНК переводятся, ранжируются и анализируются. Используя специальную команду, инициируйте PV-перевод и анализ текстовых выходных файлов первого сценария, как описано в текстовой рукописи. Выходные файлы скрипта номер два будут названы с помощью второго столбца таблицы подстановки в zuordnung.
txt с расширениями в зависимости от типа анализа. Убедитесь, что три выходных файла содержат статистические данные в первых строках и первом столбце с индексом каждой последовательности ДНК из входных текстовых файлов. Остальные столбцы должны состоять из последовательности ДНК, количества считываний, прямого или обратного считывания и транслируемой пептидной последовательности.
Недопустимые последовательности должны иметь NA и недопустимы в последних двух столбцах. Визуализируйте выходные файлы с помощью доступного программного обеспечения в зависимости от потребностей пользователя. Для выполнения анализа данных секвенирования NGS с использованием пользовательского кода в Python 3 рабочий процесс включает в себя обнаружение последовательностей штрих-кодов, управляемых фланговыми последовательностями, их длиной и расположением, а также анализ обогащения и распределения штрих-кода по набору тканей.
Подготовьте две папки: сценарий и данные. Скопируйте сжатые файлы Gzip, полученные в результате виртуализации, в папку данных. Затем скопируйте python и конфигурационные файлы в папку script, как описано в текстовой рукописи.
Перед выполнением скрипта создайте два текстовых файла с разделителями-табуляция:capsidvariance. txt-файл с последовательностями штрих-кодов, присвоенными именам вариантов капсида AAV, и загрязнением. txt-файл с последовательностями штрих-кодов, которые происходят из-за возможного загрязнения.
Наконец, отредактируйте конфигурационный файл, включив в него информацию о пути к папке с данными виртуализации, последовательности фланкирующих областей штрих-кодов, их положении и размере окна для обнаружения штрих-кода. Выполните сценарий обнаружения штрих-кода с предоставленными путями и конфигурационными файлами с помощью соответствующей команды. Результатом выполнения этой команды будут TXT-файлы с пересчетом для каждого варианта капсида и общим количеством чтений, восстановленных из необработанных данных.
Для оценки распределения капсида AAV со штрих-кодом среди тканей или органов, в zuordnung. txt, присвойте имя каждого текстового файла, полученного в результате запуска обнаружения штрих-кода, названию ткани или органа. Добавьте имена текстовых файлов в первый столбец и соответствующие названия тканей или органов в назначении с разделителями вкладок.
Создайте органы. txt файл со списком названий включенных и нецелевых органов, которые соответствуют именам, приведенным в задании zuordnung. txt-файл.
Затем создайте normalization_organ. txt и normalization_variant. Вкладка TXT разделила текстовые файлы с нормализованными значениями для всех вариантов капсида и всех органов и тканей.
В первом столбце с normalization_organ. txt, напишите названия, данные для каждого органа, а второй столбец со значениями нормализации для соответствующей ткани. Заполните первый столбец normalization_variant.
txt со списком имен capsid и вторым столбцом с нормализованными значениями количества прочитанных операций для каждого capsid в библиотеке в пуле. Отредактируйте конфигурационный файл, указав полные пути ко всем дополнительным файлам, и выполните скрипт анализа штрих-кода с помощью этой конкретной команды. Сценарий анализа штрих-кода выводит несколько файлов, таких как текстовые файлы с относительной концентрацией или RC-значениями распределения капсида в различных тканях на основе нескольких этапов нормализации, описанных ранее, и файл электронной таблицы, который объединяет данные текстового файла в объединенные матричные данные.
Визуализируйте данные и проведите кластерный анализ матричных данных, как описано в текстовой рукописи. Скрипт введет относительную концентрацию. XLS и генерируют два графика иерархической тепловой карты кластера и анализа главных компонент.
Чтобы изменить графики или параметры PNG, откройте скрипт R и следуйте инструкциям в разделе комментариев. Количественные области репсового гена AAV2 показали, что 99,2% были положительными для ITR, что позволяет предположить, что капсиды AAV содержали все вирусные геномы. Во всех трех наборах извлеченные чтения на основе последовательностей сигнатур, характерных для библиотеки, составляли около 94% от общего числа чтений, что указывает на хорошее качество.
Из них более 99% были действительными PV-чтениями, а более 99% действительных PV-чтений были уникальными, что говорит о том, что библиотека была сбалансирована с высоким внутренним разнообразием. Две основные ветви иерархии тепловой карты отражали разницу в эффективности трансдукции вариантов капсида. Левая ветвь с большинством вариантов капсида включала все капсиды, которые показали высокое относительное значение концентрации в большинстве тканей.
Помимо поразительно высокой специфичности печени, три других капсида проявляли специфичность в диафрагме, скелетных мышцах, бицепсах и мозге. Правая ветвь иерархической кластеризации включала варианты капсида с общей более низкой эффективностью трансдукции, наиболее очевидной в двенадцатиперстной кишке и поджелудочной железе. Анализ главных компонентов исходного подмножества формирует кластер вариантов капсида с высокой специфичностью печени и обрисовывает выдающийся мышечный тропизм капсида VAR60.
При попытке использовать этот протокол необходимо обращать внимание на опечатки. Синтаксис также отличается, если вы используете командную строку Windows, по сравнению с Linux. После выявления новых вариантов AAV терапевтический и трансляционный потенциал должен быть проверен на модели умершего или более крупного животного.
Этот метод позволяет проводить прямое параллельное сравнение вариантов AAV в идентичных условиях и является чрезвычайно универсальным, прокладывая путь для его трансляции у крупных животных или даже у людей.
