Наша модель invitro трехмерной сердечной мышцы человека, полученной из стволовых клеток, улучшает биоточность традиционной двумерной клеточной культуры, устраняя при этом межвидовые различия, связанные с лабораторными испытаниями на животных. Наша многотканевая конструкция биореактора со стабильными трекерами постов максимизирует успех тканей и повышает точность углубленной характеристики инженерной функции сердечной ткани. Поскольку сердечная недостаточность продолжает оставаться основной причиной смерти во всем мире, наши инженерные сердечные ткани позволяют исследователям моделировать сердечные заболевания человека, а также проводить скрининг потенциальных методов лечения.
Для начала поместите четыре алюминиевых отрицательных эталонных отливки в литой держатель так, чтобы отверстия для стоек совпали с мертвым пространством напротив треугольных полок. Поместите устройство между двумя параллельными кронштейнами и зажмите стороны вместе, используя прямоугольный кусок силиконовой пленки толщиной 0,5 миллиметра в качестве прокладки, чтобы предотвратить утечку жидкого PDMS. В неглубокой емкости смешайте 0,5 миллилитра отвердителя PDMS с пятью миллилитрами эластомера PDMS в соотношении один к 10 и энергично перемешивайте в течение пяти минут.
Дегазируйте смесь PDMS в вакуумной камере под сильным вакуумом до исчезновения пузырьков. Затем вылейте смесь PDMS на литейный аппарат, переполняя, чтобы обеспечить полное покрытие каждой щели. Добавьте маленькие цветные стеклянные бусины на корпус стоек PDMS напротив боковой стороны со стойками для уникальной идентификации каждой стойки.
Горизонтально выровненный литейный аппарат поместить в вакуумную камеру под сильным вакуумом не менее чем на 12 часов. Дайте PDMS отверждаться при комнатной температуре вдали от пыли в течение 48 часов, чтобы обеспечить полное отверждение и максимальную прочность деликатных штифтов. Снимите зажим, кронштейны и силиконовую пленку с литейного аппарата.
С помощью бритвенного лезвия из нержавеющей стали обрежьте пленку PDMS на верхней части литейного аппарата и опор рамы. Пальцами отделите стойки PDMS от боковых сторон литого держателя. Вставьте затупленное лезвие бритвы из нержавеющей стали в мертвое пространство между гипсом и литым держателем и подденьте их, убедившись, что PDMS, заполняющий мертвое пространство, остается в литом держателе.
Затем острым лезвием из нержавеющей стали срежьте оставшиеся пленки PDMS и мертвое пространство PDMS с кончиков стоек. Пальцами медленно отделите стойку PDMS от гипсовой на стороне, противоположной стойкам. Продолжайте чередовать стороны до тех пор, пока стойки не освободятся от мастер-слепков.
Освободите все стойки PDMS и стойки, как показано выше, и используйте острое лезвие бритвы, чтобы удалить все оставшиеся излишки PDMS со стоек. С помощью 3D-принтера для моделирования методом наплавления термопластов напечатайте компоненты литейного аппарата для отслеживания стабильного столба, или SPoT. Обеспечьте надежную посадку между напечатанными на 3D-принтере деталями, а также между стойками PDMS и трехзубым приспособлением.
Также убедитесь, что стойки PDMS плотно прилегают к стойкам, доходящим до дна колодцев, не сгибаясь. Смешайте 0,5 миллилитра черной части PDMS A и 0,5 миллилитра части B в небольшой весовой лодке или неглубокой емкости до тех пор, пока раствор не станет однородным по цвету. Дегазируйте смешанный черный PDMS в вакуумной камере под сильным вакуумом в течение 20 минут.
Вылейте дегазированный черный PDMS на основание, напечатанное на 3D-принтере, чтобы заполнить отверстия, и постучите, чтобы убедиться, что не осталось пузырьков. Соскребите как можно больше лишних PDMS с базы. Защелкните трехзубую деталь на основании и поместите стойки PDMS в пазы на трехзубом приспособлении, убедившись, что концы стоек погружаются в черные PDMS в круглых колодцах.
Дайте черному PDMS затвердеть при комнатной температуре вдали от пыли в течение 48 часов. Выдвиньте трехзубчатую деталь, минимизировав натяжение на стойках. С помощью маленьких щипцов соскребите тонкую черную пленку PDMS, окружающую каждый SPoT, затем вставьте изогнутые щипцы с тонким наконечником в отверстие SPoT, чтобы освободить его от 3D-печатной основы.
Осмотрите SPoT и обрежьте всю оставшуюся черную пленку PDMS в процессе литья с помощью тонких ножниц vannas. Убедитесь, что готовые стойки имеют правильную длину, установив стойки PDMS на раму мобильного телефона polys, а затем надвиньте ее на черную опорную плиту. После автоклавирования биореактора и приготовления клеточной смеси приступают к изготовлению hECT.
Надев стерильные перчатки, извлеките черную опорную пластину из автоклавного пакета, содержащего детали биореактора, и поместите ее в чашку объемом 60 миллилитров лунками вверх. Пипеткой медленно закапывайте 44 микролитра клеточной смеси в каждую лунку, чтобы избежать появления пузырьков. Надев свежие стерильные перчатки, извлеките рамку из полисульфона со стойками PDMS из автоклавного мешка.
Опустите раму на опорную плиту так, чтобы концы рамы вошли в пазы на конце опорной плиты. Убедившись, что все стойки прямые, а рама не наклонена, поместите биореактор в 60-миллиметровую тарелку. Добавьте один миллилитр 10%-ного FBS в поддерживающую среду кардиомиоцитов в чашку объемом 60 миллилитров, чтобы увеличить влажность по мере затвердевания hECT.
Поместите чашку без крышки в высокопрофильную 100-миллиметровую чашку и накройте ее 100-миллиметровой крышкой для посуды, затем верните биореактор в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, чтобы коллаген мог образовать гель с клетками во взвешенном состоянии. Через два часа достаньте посуду из инкубатора. Добавьте 13 миллилитров 10%-ного FBS в среду для поддержания кардиомиоцитов, наклоняя чашку, чтобы среда протекала между опорной пластиной из ПТФЭ и стойками PDMS.
Осмотрите биореактор сбоку на отсутствие пузырьков воздуха и верните посуду в инкубатор. Если воздух застрял, наклоните биореактор из среды, чтобы пузырь лопнул, и медленно опустите его снова, или используйте микропипетку с наконечником для загрузки геля, чтобы откачать воздух, не повредив столбы. Осмотрите уплотнение hECT через окно в раме.
В течение 24-96 часов hECT уплотняются и становятся более непрозрачными. Снимите опорную плиту, когда hECT уплотнятся не менее чем на 30% по сравнению с исходным диаметром. Наполните 60-миллиметровую чашку, содержащую биореактор, средой для поддержания кардиомиоцитов до тех пор, пока жидкость не смоется с кромкой чашки, и добавьте 14 миллилитров в новую 60-миллиметровую чашку.
Надев стерильные перчатки, переверните биореактор в чашке так, чтобы опорная пластина оказалась сверху. После осмотра на наличие застрявших пузырьков воздуха медленно поднимите опорную плиту, удерживая ее ровно. Убедитесь, что подсказки по публикациям находятся в фокусе.
Включите переключатель пороговых значений и отрегулируйте ползунок до тех пор, пока SPoT не будут четко разграничены и не изменят форму по мере сжатия hECT. С помощью инструмента «Прямоугольник» нарисуйте прямоугольник вокруг одного из SPoT и нажмите кнопку «Установить один» в поле границ столба, чтобы задать положение прямоугольника вокруг SPoT, гарантируя, что SPoT всегда остается в пределах границы прямоугольника. Повторите этот процесс с другим постом и запишите его под вторым набором.
Настройте параметры размера объекта, чтобы программа не отслеживала объекты меньшего размера, и убедитесь, что количество отслеживаемых объектов в каждом прямоугольнике остается постоянным. Интерфейс показывает измеренное расстояние между отслеживаемыми объектами в режиме реального времени. Используйте этот график для мониторинга шума.
Под заголовком частоты частоты в герцах укажите диапазон желаемых частот и желаемый интервал шага от min до max. В полях справа выберите желаемое время настройки, чтобы hECT мог приспособиться к новой частоте стимуляции, затем укажите время записи и напряжение стимуляции. Запустите программу, нажав на кнопку запуска программы.
После записи данных с одной частоты увеличьте частоту стимулятора на желаемый интервал для новой записи, пока не будет достигнута максимальная частота. Здесь показаны репрезентативные изображения hECT снизу, созданные без SPoT и с помощью SPoT. SPoT предоставляет единую определенную форму для отслеживания во время сбора данных.
В некоторых крайних случаях объект слежения даже был скрыт. Более надежная форма для оптического слежения и шумоподавления позволила измерять слабые ткани с развитой силой до одного микроньютона. SPoT обеспечивал геометрию колпачка, которая предотвращала потери hECT.
Измеренная функция hECT была стабильной в течение длительного времени культивирования в текущей установке кардиостимуляции с нагретым этапом. По сравнению с измерениями при физиологической температуре, hECT показали измененную динамику сокращения при комнатной температуре, с более медленными темпами сокращения и расслабления. На более высоких частотах hECT имели тенденцию быть слабее при комнатной температуре.
На более низких частотах hECT имели тенденцию быть сильнее при комнатной температуре. При температуре 36 градусов по Цельсию hECT имели более высокую спонтанную частоту биений и более широкий диапазон частот захвата. Среда с контролируемой температурой обеспечивает физиологическую значимость измеряемой функции hECT.
Кроме того, ванна с общей средой многотканевого биореактора облегчает изучение паракринной передачи сигналов между hECT различного клеточного состава. Добавление SPoT в наш мультитканевой биореактор позволяет исследователям эффективно изучать больной миокард с аномально высоким или низким натяжением, который в противном случае соскользнул бы с концов незакрытых штифтов.
