Этот протокол обеспечивает быстрый и специфический по размеру метод решения для небольших внеклеточных везикул за счет оптимизации параметров сортировки проточной цитометрии. Эти оптимизации предоставляют панель критических настроек сортировки, которая позволяет получать репрезентативные популяции небольших внеклеточных везикул, используя только прямое рассеяние по сравнению с разбросом по размеру. Начните с выполнения стандартной процедуры запуска сортировщика проточных ячеек.
Включите машину, нажав кнопку запуска, затем нажмите кнопку питания лазера на панели управления лазером. Нажмите кнопку замены резервуаров в подменю Smart Sampler, чтобы создать давление в жидкости. Используйте ультразвуковую очистку 50-микрометровой струи и воздушного сопла и установите его на узел сопла.
Отрегулируйте давление до 80 СИ для жидкости в оболочке и 80,3 СИ для расхода образца на напорной консоли. Нажмите кнопку запуска потока оболочки, чтобы начать поток оболочки. Нажмите пузырьковую кнопку в подменю Smart Sampler, чтобы автоматически удалить пузырь в течение 10 минут, а затем выключите его.
Чтобы выровнять поток и определить лазерное пятно, включите свет осветительной камеры, чтобы просмотреть поток через точечные отверстия. Отрегулируйте микрометры вверх и вниз, влево и вправо, а также спереди и сзади, чтобы центрировать поток на точечном отверстии и сфокусировать поток. Откройте все лазерные затворы, выберите вкладку «Перехват лазера и потока», а затем непрерывно нажимайте кнопку с зеленой стрелкой, чтобы завершить процесс лазерного перехвата и калибровки выравнивания сопла.
Доступ к экрану точной лазерной юстировки. Выберите 640-нанометровый лазер и полосовой канал 772 бар 44 в качестве параметра оси X, а 405-нанометровый лазер и полосовой канал 448 бар 59 в качестве параметра оси Y. Нажмите селектор параметров триггера и выберите параметр прямого рассеяния 488-нанометрового лазера.
Затем разбавьте радужные флуоресцентные частицы, добавив одну каплю в один миллилитр двойной дистиллированной воды до конечной концентрации от 10 до шестого шарика на миллилитр. Откройте дверцу камеры для образцов и загрузите пробирку с подготовленными радужными флуоресцентными частицами. Нажмите кнопку запуска образца и отрегулируйте микрометры вверх и вниз, чтобы оптимизировать интенсивность флуоресценции, делая каждый сигнал максимально интенсивным.
Нажмите кнопку запуска контроля качества или контроля качества на панели управления с сенсорным экраном, чтобы автоматически выполнить контроль качества. Затем нажмите кнопку инициализации IntelliSort. Прибор автоматически регулирует частоту и амплитуду колебаний капли, чтобы получить задержку капли примерно 25 и иметь возможность четко визуализировать точку отрыва капли.
Затем нажмите кнопку задержки падения и кнопку поддержания. Выберите трубку в качестве типа вывода сортировки. Поместите 15-миллилитровый держатель трубки в камеру сортировки.
Включите напряжение пластины и установите напряжение пластины примерно на 4 000 вольт. Затем включите тестовый шаблон, нажав кнопку настройки потока. Отрегулируйте ползунок фазы заряда и ползунок отклонения, чтобы убедиться, что изображение потока соответствует сборной трубке.
Затем нажмите кнопку с галочкой. Войдите в рабочую станцию Summit на компьютере. Создайте новый протокол из главного меню файла.
Затем создайте точечную диаграмму, выбрав вкладку гистограммы на панели управления Summit Software. Выберите прямой разброс в качестве параметра оси X и боковой разброс в качестве параметра оси Y. Затем щелкните правой кнопкой мыши ось нового точечного графика в рабочей области и представьте прямой разброс и боковой разброс в логарифмической форме.
Выберите вкладку сбора данных и найдите панель параметров сбора данных. Включите все сигналы в подменю включения параметров. Выберите форвардный скаттер в качестве параметра триггера и установите порог 0,01.
Отрегулируйте напряжение и коэффициент усиления прямого рассеяния и бокового рассеяния на 250 и 0,6, чтобы обеспечить разделение событий на графике прямого рассеяния и бокового рассеяния и популяциях. Разбавьте флуоресцентные полистирольные микросферы в суспензиях размером 100, 200 и 300 нанометров, добавив один микролитр микросфер к одному миллилитру двойной дистиллированной воды. Затем последовательно загружайте микросферу суспензией.
Выберите «Пуск» в меню сбора данных Summit Software, чтобы записать 20 000 событий, а затем нажмите «Стоп» после записи событий. Щелкните правой кнопкой мыши на графике точек прямого разброса и бокового разброса, чтобы создать прямоугольники, и перетащите их, чтобы изменить размер. Переместите области электронного шума и 100-нанометровой микросферы, щелкнув правой кнопкой мыши области, чтобы переименовать их в R7 и R4 соответственно.
Повторите шаги, чтобы последовательно обрамить 200- и 300-нанометровые микросферы прямоугольниками и переименовать их в R5 и R6 соответственно. Наконец, определите область сортировки от 50 до 200 нанометров на основе электронного шума и положения частиц размером 200 нанометров, чтобы определить ее как R8. Отредактируйте решения сортировки на панели логики сортировки и статистики, дважды щелкнув пустое поле левого потока или потока L1 и выбрав область с именем R8, чтобы создать логику сортировки. Выберите режим чистоты прерывания и выберите оболочкой для капель выше одной капли для потока L1.
Загрузите 500 микролитровый образец предварительно подготовленной внеклеточной смеси везикул или EV. Нажмите кнопку «Пуск» в меню сбора данных в Summit, чтобы получить данные, а затем нажмите «Остановить». Затем нажмите «Пуск» в меню сортировки, чтобы собрать небольшие внеклеточные везикулы размером от 50 до 200 нанометров или sEV в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров.
Проточный цитометрический анализ полистирольных микросфер стандартного размера для определения диапазона размеров от 50 до 200 нанометров на диаграмме прямого рассеяния и бокового рассеяния выявил различимые сигналы частиц. R4, R5 и R6 относятся к положениям частиц размером 100, 200 и 300 нанометров соответственно. R7 - это электронный шум в качестве предела обнаружения для 50-нанометровых частиц, а R8 представляет собой диапазон положения частиц от 50 до 200 нанометров.
Распределение частиц по размерам смеси EV, полученной из клеток поджелудочной железы с помощью анализа отслеживания наночастиц, или NTA, находилось в широком диапазоне от 40 до 400 нанометров после ультрацентрифугирования. Проточная цитометрическая сортировка проводилась для выделения и очистки sEV от 50 до 200 нанометров в области R8. Качество выделения было проверено NTA, и было обнаружено, что диапазон размеров частиц sEV после сортировки составлял от 50 до 200 нанометров.
Присутствие sEV также наблюдалось с помощью TEM, и было подтверждено, что изолированные sEV содержат маркеры CD6, CD63 и CD81 с помощью вестерн-блоттинга. Этот метод позволяет разделять небольшие внеклеточные везикулы и классифицировать или анализировать экспрессию генов малых внеклеточных везикул, открывая многочисленные последующие исследовательские приложения.
