Этот метод позволяет производить отбор проб молока из небольшой образцовой рыбы, японской мадаки, и последовательно исследовать его качество. В частности, сбор спермы с помощью абдоминального массажа позволяет повторно отбирать у одной и той же рыбы, поскольку этот подход не является инвазивным. Кроме того, эта техника может быть применена для криоконсервации спермы Мадака.
Качество спермы является важным показателем успешности оплодотворения и, следовательно, важным параметром для анализа в экологических и целых продуктивных физиологических исследованиях. Для начала приготовьте мягкую губку, разрезав ее, чтобы она самодовольно поместилась в чашку Петри. Вырежьте прямую линию в середине губки, которая достаточно длинна, чтобы удерживать рыбу на брюшной стороне вверх.
После обезболивания рыбы высушите брюшко рыбы, аккуратно протерев его бумажным полотенцем. Поместите рыбу в корыто влажной держащей губки вентральной стороной вверх, чтобы ее жабры подвергались воздействию раствора анестетика в губке. Если область вокруг клоаки влажная, осторожно высушите нижнюю сторону живота одноразовой салфеткой.
Под рассекающим микроскопом поместите микропипетку с прикрепленной аспираторной трубкой против клоаки рыбы. Теперь массируйте живот рыбы, аккуратно сжимая тупым концом гладкие щипцы в ростральном каудальном движении. Для восстановления рыбы выпустите ее из губки в заранее подготовленную восстановительную воду перед возвращением рыбы в аквариумную систему.
Переложите собранное молоко в трубку, содержащую предварительно нагретый активирующий раствор и раствор пипетки вверх и вниз несколько раз, используя аспираторную трубку в сборе. Гомогенизируйте разбавленную сперму осторожно, щелкнув трубками перед анализом. После усыпления рыбы высушите ее, как было показано ранее, и поместите рыбу под рассекающий микроскоп левой боковой стороной вверх.
Используя небольшие рассекающие ножницы, вырежьте лоскут дорсально от клоаки, а затем через ребра к жабрам, чтобы обнажить внутренние органы. Найдите яички и вырежьте крепление с обоих концов тонкими щипцами. Удалите яички и переложите их в подготовленную пробирку, содержащую предварительно нагретый активирующий раствор.
Используйте щипцы, чтобы раздавить яички несколько раз о сторону трубки, чтобы выпустить сперму, которая может быть визуализирована слегка мутным внешним видом раствора. Чтобы начать анализ, откройте программное обеспечение для анализа спермы и выберите модуль подвижности. Установите конфигурации в программном обеспечении для всех параметров.
Поместите предварительно нагретую одноразовую 20-метровую счетную камеру под микроскоп на нагретую сцену, установленную на 27 градусов Цельсия. Пипетка образца в камеру на слайде до тех пор, пока он не заполнится, но без перелива. Тщательно вытирайте лишние образцы со входа в камеру, чтобы предотвратить дрейфующее движение клеток в растворе.
Выберите анализ, чтобы посмотреть на образец под микроскопом. Убедитесь, что микроскоп сфокусирован и снова выберите анализ, чтобы записать сперму в поле. Переместите слайд в новую область образца в кадре и повторите процедуру для трех-пяти различных полей зрения, избегая пузырьков воздуха, масс ячеек или артефактов.
Чтобы просмотреть результаты, выберите результаты и дважды щелкните по полю, чтобы визуализировать отдельное поле или вручную проверить наличие неправильно помеченных или неотслеженных сперматозоидов. При необходимости щелкните правой кнопкой мыши на отдельных сперматозоидах, чтобы перемаркировать подвижность. В настоящем исследовании компьютерный анализ спермы использовался для записи различных параметров скорости и движения.
Вычисляемые значения включают индекс прямолинейности, индекс линейности и колебание. Осмолярность активационных растворов влияла на подвижность сперматозоидов от рассечения яичек. Сперматозоиды были неподвижными в аквариумной воде, но подвижными в HBSS с высокой и низкой осмолярностью.
Однако подвижность значительно снижается при 36 милли осмол на килограмм, по сравнению с растворами с более высокой осмоляльностью. На подвижность также повлиял метод сбора спермы, при котором сперматозоиды значительно более подвижны в методе рассечения яичка по сравнению с абдоминальным массажем. Кроме того, более высокий процент клеток был прогрессивным, и больше клеток были либо средними, либо быстро движущимися.
Процент подвижности и прогрессивности значительно выше в сперме, хранящейся при четырех градусах Цельсия или на льду, по сравнению с хранением 27 градусов по Цельсию. Условия окружающей среды и жилья также незначительно повлияли на подвижность сперматозоидов. Существенной разницы в подвижности сперматозоидов не наблюдалось в сперме, собранной после и перед нерестом.
Самцы, размещенные без самок в течение месяца, показали высокую моторику, но разница была незначительной. Для сбора спермы с помощью массажа живота необходима тренировка, чтобы научиться правильному давлению и движению щипцов и избежать фековых загрязнений. Этот метод будет очень полезен для изучения, например, воздействия различных загрязнителей на мужскую фертильность в экотоксикологических исследованиях, где Медака является широко используемой моделью.
