Здесь мы описали протокол, который поможет другим в исследовании механизмов дисбактериоза при заболевании, от сбора образцов фекалий до использования метода швейцарского ролла для изучения изменений в кишечнике. Для начала опрыскайте грудь и бока усыпленной мыши 70% этанолом и осторожно вскройте кожу и брюшную полость, чтобы обнажить желудочно-кишечный тракт. Изолируйте слепую кишку и используйте стерильные хирургические ножницы, чтобы разрезать ее пополам.
Ненадолго обнажите слепую кишку и отрежьте 0,5 сантиметра проксимально от подвздошной кишки и 0,5 сантиметра дистально на ее стыке с толстой кишкой. Переложите изолированную слепую кишку на стерильную чашку Петри. Используйте стерильный шпатель для переноса содержимого слепой кишки в стерильные пробирки и храните аликвоты в морозильной камере при температуре 80 градусов по Цельсию.
Повторно суспендировать свежие или ранее замороженные фекальные гранулы в стерильном физиологическом растворе в пропорции 1 к 20 и перемешивать до гомогенизации. Пропустите гомогенат через нейлоновый фильтр с 30-микрометровыми порами, чтобы удалить крупные твердые частицы. Центрифуга при 79G в течение пяти минут и соберите надосадочную жидкость, чтобы использовать ее для трансплантации.
Пероральный зонд 100 микролитров суспензии на мышь-реципиента без микробов в течение трех дней подряд, а затем зонд каждые три дня в течение двух недель. Аккуратно поместите мышь в удерживающие устройства на предварительно нагретый держатель мыши и оставьте хвост снаружи. Аккуратно заклейте верхнюю часть, не зажимая ее, чтобы не напрягать мышь.
Дайте мыши отдохнуть в держателе и поместите ее на платформу машины с хвостовой манжетой на три-пять минут, накрыв простыней для акклиматизации. Соберите не менее трех раундов измерений систолического давления с помощью плетизмографии хвостовой манжеты и усредните измерения всех раундов для среднего систолического давления для каждого животного. Асептически собирают содержимое слепой кишки у усыпленной мыши.
Чтобы собрать кишечник и другие ткани, найдите ткани у мыши и иссеките их ножницами, чтобы изучить роль микробиоты кишечника в кардиометаболическом здоровье. В первый день рассеките кишку мыши от анальной стороны до стороны желудка. И поместите весь изолированный желудочно-кишечный тракт в чашку Петри, содержащую PBS.
Аккуратно оттяните проксимальный конец от конца живота и удалите окружающий жир и соединительную ткань рукой. Изолируйте тонкую кишку и сделайте зигзаг Z-типа с каждой длиной. Затем разрезают, чтобы получить двенадцатиперстную кишку, тощую кишку и подвздошную кишку.
Изолируйте толстую кишку, разрезав участок кишечника ниже слепой кишки. Разрежьте двенадцатиперстную кишку, тощую кишку, подвздошную кишку и толстую кишку. Используйте шприц и иглу с шариковым наконечником, чтобы тщательно промыть и промыть кишечник внутри PBS, не разрывая кишечник.
Поместите кишку на фильтровальную бумагу и пометьте бумагу названием раздела, а затем P в верхнем левом углу для проксимального или D для дистального в левом нижнем углу. Разрежьте кишку в продольном направлении шариковыми ножницами. Откройте кишку на фильтровальной бумаге и промойте большим количеством PBS по мере необходимости.
Поместите кишку между двумя фильтровальными бумагами и скрепите фильтровальную бумагу в четырех точках или углах рядом с кишкой. Замочите в 10%-ном нейтральном буферном растворе формалина и встряхните с помощью коромысла платформы при пяти оборотах в минуту на ночь при комнатной температуре. На второй день нагрейте приготовленную 2%-ную агарозу в дистиллированной воде с помощью мешалки в стакане, покрытом алюминиевой фольгой.
Чтобы извлечь ткани, снимите верхнюю фильтровальную бумагу и сверните кишку с проксимальной стороны так, чтобы проксимальная сторона сначала вошла внутрь, и сверните внутрь, чтобы просвет также оказался внутри предметного стекла. Приколите иглой 30-го калибра или двумя по мере необходимости. Аспирируйте один миллилитр агарозы с помощью одноразовых пипеток для переноса и вылейте агарозу на свернутый срез кишки на плоской поверхности, избегая пузырьков воздуха в тканях.
После того, как агароза остынет и затвердеет, используйте лезвие бритвы, чтобы обрезать лишнюю агарозу вокруг участка ткани. Наконец, поместите срезы кишечника в кассеты для обработки тканей или встраивания и замочите их в 70% этаноле при четырех градусах Цельсия. Показана оценка видового биоразнообразия по содержанию слепой кишки, полученной от мышей на нормальных соляных диетах и диетах с высоким содержанием соли.
Изменения в микробиоте кишечника в ответ на высокое содержание соли включали снижение биоразнообразия бактерий. Неметрическое многомерное масштабирование показывает, что бактерии мышей с нормальной солью и мышами с высоким содержанием соли образуют отдельные кластеры. Высокое содержание соли связано с повышенным соотношением Firmicutes и Bacteroidetes.
Трансплантация фекальной микробиоты от мышей с высоким содержанием соли предрасполагает безмикробных мышей к гипертонии, вызванной ангиотензином II. Перенос дисбиотической микробиоты кишечника, вызванной высоким содержанием соли, был связан со значительным повышением систолического давления у безмикробных мышей по сравнению с мышами, получавшими нормальную солевую микробиоту кишечника. Репрезентативные изображения показывают окрашивание аполипопротеина A-I в подвздошной кости, полученное от мышей, у которых была гиперлипидемия без протеинурии или с протеинурией.
Этот протокол согласовывает шаги по достижению успешной ТФМ в ключевых экспериментальных соображениях как для людей, так и для доноров грызунов.
