Наш протокол обеспечивает как жизнеспособность клеток, так и эффективность изоляции одноклеточной суспензии при относительно низких затратах. Относительно низкие затраты и требования к лабораторному оборудованию являются основными преимуществами этой методики. Секвенирование отдельных клеток выявляет гетерогенность некардиомиоцитов в патофизиологии сердца, а также дает идеи для фундаментальных и клинических исследований сердечных заболеваний.
Этот протокол может быть использован в исследованиях сердечно-сосудистой среды после инфаркта миокарда, такой как участие иммунных клеток. При первом приготовлении я предлагаю обратить особое внимание на образец пепсина и время переваривания. После того, как буферы и растворы будут приготовлены, как описано в рукописи, поместите на хирургический стол усыпленную мышь, перенесшую инфаркт миокарда двумя неделями ранее, в лежачем положении.
Зафиксируйте его задние конечности с помощью скотча. Чтобы иссечь сердце, опрыскайте тело 70% этанолом. Сделайте вертикальный разрез через кожу живота и мышцы, избегая печени.
Не прокалывая сердце, осторожно вскройте грудную клетку и протрите левый желудочек предварительно охлажденным раствором PBS до тех пор, пока перфузионная жидкость не станет бесцветной. С помощью щипцов аккуратно приподнимите сердце и офтальмологическими ножницами срежьте лишние ткани, прикрепленные к его внешней стороне. Поместите сердце в один миллилитр предварительно охлажденного PBS в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра.
Перенесите сердце в колодец из 24-луночной пластины, помещенной на лед. Запипейте 150 микролитров сердечного диссоциативного буфера в лунку и разрежьте сердце на кусочки размером в один миллиметр с помощью ножниц. Переведите измельченную сердечную ткань в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров, содержащую пять миллилитров буфера диссоциации тканей.
Поместите трубку в термостатический возвратно-поступательный шейкер. Пипетите суспензию вверх и вниз 10 раз каждые 20 минут. Чтобы удалить комки и непереваренную ткань, отфильтруйте клеточную суспензию через 70-микрометровый клеточный фильтр, используя 25 миллилитров буфера для промывки клеток.
Промойте центрифужную пробирку и сетчатый фильтр. Затем отфильтруйте клеточную суспензию через 40-микрометровый клеточный фильтр, чтобы удалить дополнительные клеточные скопления. Центрифугируйте отфильтрованную клеточную суспензию при 300 х г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
Ресуспендировать образец клетки в пяти объемах буфера для лизиса эритроцитов и инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре. Теперь добавьте четыре объема буфера для промывки клеток в клеточную суспензию и центрифугу, как показано ранее. После удаления надосадочной жидкости ресуспендируйте клетки в 10 миллилитрах буфера для промывки клеток и снова центрифуги.
В конце центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в одном миллилитре буфера для промывки клеток. Возьмите 18 микролитров суспензии в другую центрифужную пробирку и добавьте два микролитра раствора для окрашивания йодида пропидиума акридина оранжевого. Добавьте 10 микролитров этого окрашенного раствора в предметное стекло счетной камеры.
Оцените количество клеток и жизнеспособность с помощью автоматического счетчика ячеек. Фрагменты клеток наблюдались в одноклеточной сердечной подвеске. Сортировка клеток, активированная флуоресценцией, эффективно уменьшала долю клеточных фрагментов и слипания клеток, что приводило к уменьшению среднего размера клеток.
Секвенирование РНК доказало очевидное разделение семи типов иммунных клеток, о чем свидетельствует неконтролируемая кластеризация и уменьшенное Т-распределенное стохастическое встраивание соседей. Каждая иммунная клетка показала высокую экспрессию классических маркеров. Сердечная ткань должна быть разрезана достаточно мелко, чтобы избежать неполного пищеварения, что приводит к большому количеству клеточных комков в клеточной суспензии.
Одноклеточная суспензия, полученная по этому протоколу, может быть дополнительно применена в проточном анализе первичной клеточной культуры. Этот протокол полезен для исследований микроокружения инфекции миокарда, что может помочь исследователям выйти за рамки сердечных тканей и рассматривать инфекцию миокарда как систематическую проблему.
