Nuestro protocolo garantiza tanto la viabilidad celular como la eficiencia de aislamiento de la suspensión unicelular a costos relativamente bajos. Los costos relativamente bajos y los requisitos para el equipo de laboratorio son las principales ventajas de esta técnica. La secuenciación de células individuales revela la heterogeneidad de los no cardiomiocitos en la fisiopatología cardíaca, y también proporciona ideas para estudios básicos y clínicos para enfermedades cardíacas.
Este protocolo se puede utilizar en estos estudios sobre el entorno cardiovascular post-IM, como la participación de las células inmunes. Para las preparaciones por primera vez, sugiero que se preste especial atención a la pepsina de la muestra y al tiempo de digestión. Una vez que los tampones y las soluciones estén preparados como se describe en el manuscrito, coloque un ratón sacrificado que tuvo un infarto de miocardio dos semanas antes en posición supina en la mesa quirúrgica.
Fije sus extremidades posteriores con cinta adhesiva. Para extirpar el corazón, rocíe el cuerpo con etanol al 70%. Haga una incisión vertical a través de la piel abdominal y los músculos mientras evita el hígado.
Sin perforar el corazón, abra cuidadosamente el tórax y profunde el ventrículo izquierdo con una solución de PBS prefría hasta que el líquido de perfusión se vuelva incoloro. Usando fórceps, levante suavemente el corazón y corte el exceso de tejidos adheridos a su exterior con tijeras oftálmicas. Coloque el corazón en un mililitro de PBS preenfriado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Transfiera el corazón a un pocillo de una placa de 24 pocillos colocada en hielo. Pipet 150 microlitros del amortiguador de disociación cardíaca en el pozo, y cortar el corazón en trozos de un milímetro con tijeras. Transfiera el tejido cardíaco picado a un tubo centrífugo de 15 mililitros que contenga cinco mililitros del tampón de disociación tisular.
Coloque el tubo en una agitadora reciprocante termostática. Pipet la suspensión hacia arriba y hacia abajo 10 veces cada 20 minutos. Para eliminar los grumos y el tejido no digerido, filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 micrómetros utilizando 25 mililitros de tampón de lavado celular.
Enjuague el tubo de centrífuga y el filtro celular. A continuación, filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 40 micrómetros para eliminar más grupos celulares. Centrifugar la suspensión de celda filtrada a 300 x g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Resuspender la muestra celular en cinco volúmenes de tampón de lisis RBC e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Ahora, agregue cuatro volúmenes del tampón de lavado celular en suspensión celular y centrífuga como se demostró anteriormente. Después de desechar el sobrenadante, resuspenda las celdas en 10 mililitros del tampón de lavado celular y centrifugar una vez más.
Al final de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón de lavado celular. Tome 18 microlitros de la suspensión en otro tubo de centrífuga y agregue dos microlitros de solución de tinción de yoduro de propidio de naranja acridina naranja. Agregue 10 microlitros de esta solución teñida a un portaobjetos de cámara de conteo.
Evalúe el número de celdas y la viabilidad utilizando un contador automático de celdas. Se observaron fragmentos celulares en la suspensión cardíaca unicelular. La clasificación celular activada por fluorescencia redujo efectivamente la proporción de fragmentos celulares y la aglutinación celular, lo que resultó en una disminución del tamaño promedio de la célula.
La secuenciación del ARN demostró una separación obvia de siete tipos de células inmunes, como lo demuestra la agrupación no supervisada y la incrustación reducida del vecino estocástico distribuido en T. Cada célula inmune mostró una alta expresión de marcadores clásicos. El tejido cardíaco debe cortarse lo suficientemente pequeño como para evitar una digestión incompleta, lo que conduce a muchos bultos celulares en la suspensión celular.
La suspensión unicelular obtenida por este protocolo se puede aplicar aún más en el análisis de flujo del cultivo celular primario. Este protocolo beneficia los estudios sobre el microambiente de la infección miocárdica, lo que puede ayudar a los investigadores a mirar más allá de los tejidos cardíacos y considerar la infección miocárdica como un problema sistemático.
