В этом методе сила непосредственно прикладывается к ядру. Это отделяет эффект передачи силы от клеточной плазматической мембраны и цитоскелета, выявляя молекулярные механизмы ядерного механозондирования. Сила прикладывается внутри живых клеток неинвазивным способом.
По сравнению с оптическим пинцетом, магнитное поле и магнитная сила не влияют на функции ячейки и имеют более высокую пропускную способность. Начните культивирование клеток с помощью магнитных микрошариков, взвесив 0,2 грамма карбонильных железных микрогранул, имеющих семь микрометров среднего диаметра. Суспендировать микрогранулы в одном миллилитре RPMI 1640 с помощью пипетки.
Затем отнесите чашку Петри с B2B-клетками в шкаф биобезопасности и быстро добавьте в чашку Петри 200 микролитров среды, содержащей микрогранулы. Поместите чашку Петри в инкубатор до тех пор, пока микрошарики не усвоятся клетками. Откройте инвертированный микроскоп и, используя конфокальную флуоресцентную визуализацию, определите оптимальное время для интернализации клеточных линий каждые шесть часов, визуализируя микрогранулу, ядерную и клеточную границу.
Интернализованные микрошарики будут присутствовать в пределах границы клетки. Для применения малых усилий и визуализации живых клеток откройте программное приложение Elements. Чтобы определить конфигурацию магнитной находки, нажмите кнопку «один на два», чтобы установить скорость сканирования на один кадр в две секунды.
Установите размер точечного отверстия на 1.2 Airy unit. Проверьте только канал FITC и установите PMT HV как 70, смещение как ноль, интенсивность лазера как 10. Чтобы определить конфигурацию магнитного ядра YAP, установите скорость сканирования на один кадр в четыре секунды, нажав кнопку «один на четыре».
Затем нажмите кнопку 1.2 Airy unit, чтобы установить размер точечного отверстия на 1.2 Airy unit и проверьте канал FITC. Установите PMT HV как 70, смещение как ноль, интенсивность лазера как 10. Для визуализации границы ядра и интенсивности ядерного пятна проверьте канал цианина 5.
Не нажимайте кнопку устройства 1.2 Airy и установите PMT HV на 70, смещение до нуля и интенсивность лазера до 10. Размер точечного отверстия будет оптимизирован для трехмерной YES-ассоциированной визуализации белка. Затем включите DIA через Элементы.
Откройте спин-вид, используйте яркое поле и настройте фокус объекта, чтобы получить четкое изображение клеток в фокусе. Используйте объектив 10X, чтобы найти подходящие несколько одиночных клеток в трех условиях, таких как клетка с одной микрогранулой внутри, с несколькими микрошариками внутри и без какой-либо микрогранулы внутри. Затем переключитесь на цель 40X и назовите эту позицию соответствующим номером позиции.
Откройте Элементы, нажмите на магнитный поиск, снимите блокировку, затем сканируйте вкладки, затем выберите верхнюю и нижнюю кнопки, чтобы настроить положение Z фокальной плоскости для установки нижнего и верхнего предела для стека Z выбранных ячеек. Остановите сканирование, нажав кнопку Сканировать еще раз. Переключитесь на конфигурацию магнитного ядра YAP и задайте имя файла как before_small_force.nd2.
Нажмите на кнопку запуска с записанным стеком Z. Переключитесь на правый путь света и включите DIA. Откройте вращательный вид и нажмите кнопку записи.
Переместите магнит на 46 миллиметров над дном чашки Петри, вращая ручку движущегося устройства магнита. Сохраните и проверьте видео, чтобы подтвердить смещение микрошариков, вызванное магнитной силой. Повторите процедуру сканирования, установив имя файла как after_small_force.nd2.
Затем переключитесь на правый световой путь, включите DIA и откройте режим вращения, прежде чем нажать на кнопку записи. Покрутите ручку движущегося устройства магнита на высоте до 120 миллиметров над дном чашки Петри и сохраните последовательность изображений или видео с ярким полем. Повторите шаги сканирования, установив для имени файла значение before_large_force.nd2.
Микрошарики не могут излучать флуоресценцию при лазерном возбуждении в канале FITC или цианина 5. Таким образом, интернализованные микрошарики были идентифицированы по темной впадине, расположенной в конфокальной визуализации флуоресценции YES-ассоциированного белка и ядра. Ядерная цикличность не показала существенной разницы между контрольными клетками и клетками с интернализацией микрогранул.
YES-ассоциированное отношение ядра белковой клетки к цитоплазме контрольных клеток, культивируемых совместно с микрогранулой, но без интернализации, и клеток с интернализацией микрошарики также не показало существенной разницы. Деформация ядра и деполимеризация актина были вызваны силой сжатия, приложенной микрошариками в клетках, содержащих цитоскелет. Калибровочная кривая количественного анализа изображений, обеспечиваемая количественной зависимостью смещения силы AFM.
Исходя из этой взаимосвязи, была оценена приложенная сила бусин. Деформация ядра и YES-ассоциированная транслокация белка наблюдались при приложении или высвобождении магнитной силы. Изменения интенсивности YES-ассоциированного белка в зеленом канале и отсутствие изменений в окрашивании ядра в красном канале подтвердили, что вызванная магнитной силой ядерная деформация вызвана транслокацией белка, связанного с YES.
Количественная оценка чистого изменения отношения ядра и цитоплазмы к цитоплазме, связанного с YES, подтвердила, что магнитная сила, приложенная к микрошарикам в цитоплазме, индуцировала транслокацию белка, связанную с YES, и изменила отношение ядра белка к цитоплазме, связанного с YES. Прежде чем прикладывать силу и визуализировать, убедитесь, что клетки усвоили магнитные микрошарики, а бусины находятся в пределах клеточной границы.
