Наша модель очень актуальна для демиелинических заболеваний, особенно рассеянного склероза. И это может способствовать соответствующему продвижению клинически значимых исследований. Это подробный протокол, который может непосредственно вызвать тяжелую демиелинизацию быстро и стабильно у мышей с помощью хирургической процедуры.
Пробуя эту технику в первый раз, будьте терпеливы и убедитесь, что координаты точны. Начните с подключения иглы 32-го калибра к 5-микролитровому шприцу. Выводят 5 микролитров раствора LPC для приготовления инъекции.
Далее подтвердите глубину анестезии мыши отсутствием рефлекса защемления пальцев ног при гладком дыхании. Поместите мышь в стереотаксическую рамку спинной стороной вверх и закрепите голову носовым конусом и зубным зажимом. Прикрепите мышь к стереотаксическому аппарату с помощью двусторонних ушных вкладышей.
Убедитесь, что ушные вкладыши ровные, а голова горизонтальная и устойчивая. Дезинфицируйте кожу головы, протирая йодофором. Затем используйте скальпель, чтобы разрезать небольшой разрез примерно до 1,5 сантиметров вдоль средней линии кожи головы, чтобы обнажить череп.
Протрите навык ватным тампоном, смоченным в 1% перекиси водорода, пока не обнажаются брегма, лямбда и задний родничок. Поместите шприц на стереотаксический аппарат. Обеспечьте горизонтальное расположение головы животного и найдите мозолистое тело.
Как только место инъекции определено, запишите координаты и сделайте отметку маркером на черепе. Аккуратно просверлите отмеченный участок с помощью сверла черепа. Позаботьтесь о том, чтобы избежать кровотечения.
Медленно перемещайте иглу к заданным координатам. Чтобы индуцировать демиелинизацию мозолистого тела, вводят 2 микролитра раствора LPC в каждое место инъекции со скоростью 0,4 микролитра в минуту. После инъекции держите иглу в каждом месте в течение дополнительных 10 минут.
Наконец, зашить кожу швом 4-0 и подождать, пока животное проснется в течение 10 минут. Репрезентативное изображение показывает обнаружение легионов белого вещества с помощью быстрого синего окрашивания Luxol. Из результатов стабильная демиелинизация мозолистого тела может наблюдаться через 10 и 28 дней после инъекции.
Здесь показана количественная оценка области демиелинизации в разные моменты времени. Благодаря иммунофлуоресцентному окрашиванию деградировавшего основного белка миелина наблюдалось заметное увеличение dMBP в группе, вводимой LPC через 10 дней после инъекции, что представляет собой потерю миелина в мозолистом теле. Вестерн-блоттинговый анализ экспрессии основного белка миелина, или MBP, показал значительную потерю MBP после инъекции LPC.
Бета-актин использовался в качестве регулятора нагрузки для измерения базового выражения. Изображения электронной микроскопии подтверждают миелинизированную ультраструктуру в мозолистом теле фиктивной группы и LPC-инъекционной группе. GST-pi является маркером созревания клетки-предшественника олигодендроцитов, или OPC, дифференцировки.
После 10 дней инъекции LPC GST-pi снизился по сравнению с фиктивной группой. В то же время пролиферационная способность олигодендроцитов может отражаться соотношением пролиферированных олигодендроцитов и общего количества клеток линии олигодендроцитов. Более высокое соотношение представляет собой большую пролиферацию олигодендроцитов через 10 дней после инъекции.
Репрезентативные изображения показывают плавательную дорожку мышей в каждой группе, в присутствии платформы и после снятия платформы. Результаты показывают, что пространственная память демиелинизированных мышей значительно нарушена в двухточечной модели инъекции LPC. При попытке этой процедуры убедитесь, что скорость инъекции точна, и держите иглу в каждом месте в течение дополнительных 10 минут.
