In diesem Video wird ein Protokoll zur Erstellung und Verwendung trockener makroporöser Alginatgerüste beschrieben, die als Drydux bekannt sind und die Transduktion aktivierter T-Zellen effizient fördern. Drydux wurde entwickelt, um anstelle der Goldstandard-Spinokulation von mit Viren beimpften RetroNectin-beschichteten Platten verwendet zu werden und vereinfacht den Prozess der Zelltransducation. Drydux hat eine Transduktionseffizienz, die mit der Spinokulation auf RetroNectin-beschichteten Platten vergleichbar ist, und dient als kostengünstigere und bequemere Alternative zur herkömmlichen Transduktionsmethode.
Bereiten Sie zunächst eine 0,4% ige Lösung von Calcium-D-gluconat vor. Fügen Sie steriles gefiltertes DI-Wasser zu Calcium-D-gluconat in einem Becherglas hinzu. Bei mittlerer Geschwindigkeit umrühren, bis sich das Calcium-D-gluconat aufgelöst hat, was ca. 1 1/2 Stunden dauert.
Nach dem Auflösen steril filtrieren Sie die Calcium-D-gluconat-Lösung. Diese Lösung kann bei Raumtemperatur gelagert werden. Als nächstes bereiten Sie eine 2% ige Alginatlösung vor.
Dies kann mit einem Schraubverschlussfläschchen oder einem Becherglas erreicht werden. Beides wird hier gezeigt. Geben Sie das hochreine Alginat vorsichtig in das Gefäß.
Fügen Sie dem Alginat die entsprechende Menge DI-Wasser hinzu. Wählen Sie den größtmöglichen Rührstab, der das Mischen nicht behindert, und fügen Sie ihn dem Gefäß hinzu. Rühren Sie die Lösung hoch, bis sich das Alginat auflöst, was ungefähr eine Stunde dauert.
Wenn sich große Alginatklumpen an der Seite des Gefäßes befinden, neigen Sie das Gefäß zur Seite, um sie zu entfernen. Kleine Klumpen lösen sich im Laufe der Stunde auf und sind kein Grund zur Besorgnis. Sobald sich die 2%ige Alginatlösung aufgelöst hat, reduzieren Sie die Rührgeschwindigkeit.
Geben Sie langsam ein gleiches Volumen der Calcium-D-gluconat-Lösung in die Alginatlösung. Wenn Sie es langsam hinzufügen, können Sie verhindern, dass sich vernetzende Klumpen bilden. Wenn die Calciumgluconatlösung hinzugefügt wurde, erhöhen Sie die Rührgeschwindigkeit und rühren Sie 15 Minuten lang kräftig um.
Neigen Sie das Gefäß zur Seite, um eventuell gebildete Klumpen zu entfernen. Nach 15 Minuten kräftigem Rühren stellen Sie sicher, dass sich keine Klumpen in der Lösung befinden. Pipetten Sie die Lösung in eine 48- oder 24-Well-Platte.
Für eine 48-Well-Platte pipetten Sie 300 Mikroliter in jede Vertiefung. Stellen Sie sicher, dass Sie langsam werfen und die Spitzen häufig wechseln, da die Lösung viskos ist und an der Spitze haften bleiben kann. Für eine 24-Well-Platte pipetten Sie einen Milliliter in jede Vertiefung.
Wieder langsam gießen und Pipettenspitzen oft wechseln. Die Brunnenplatten mit einem Deckel abdecken und über Nacht bei minus 20 Grad Celsius einfrieren. Bereiten Sie die Platten für den Gefriertrockner vor, indem Sie die Deckel entfernen und die Oberseite mit Tüchern und Gummibändern sichern.
Legen Sie die Platten in das Gefriertrocknungsrohr und legen Sie den Gefriertrockner für 72 Stunden auf. Entfernen Sie nach 72 Stunden die Platte aus dem Gefriertrockner. Die Gerüste sind nun bereit für die Transduktion.
Wenn Sie die Gerüste nicht sofort verwenden, verschließen Sie die Platte mit Parafilm und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius, bis sie benötigt werden. Für die Langzeitlagerung empfiehlt es sich, die Platte zusätzlich zur Versiegelung mit Parafilm vakuumversiegeln. Viralüberstand konzentrieren, indem zwei Milliliter Viruslösung durch einen Zentrifugalfilter bei 1.500 g für 10 Minuten zentrifugiert werden.
Pro Gerüst werden 100 bis 200 Mikroliter konzentriertes Virus benötigt. Für einige zusätzliche Minuten drehen, wenn das Volumen der konzentrierten Viruslösung mehr als 200 Mikroliter beträgt. Für jedes Gerüst wird ein Aliquot von 1 Million aktivierter T-Zellen in 50 Mikrolitern kompletter Zellkulturmedien suspendiert.
Fügen Sie das konzentrierte Virus der Zellsuspension hinzu. Das Gesamtvolumen der Zellvirussuspension sollte 200 Mikroliter für ein 48-Well-Gerüst oder 350 Mikroliter für ein 24-Well-Gerüst nicht überschreiten. Fügen Sie die Zellvirusmischung tropfenweise auf die Oberseite des trockenen Gerüsts hinzu.
Verwenden Sie für Negativkontrollexperimente vollständige Zellkulturmedien anstelle von konzentriertem Virus. Fügen Sie diese Zellsuspension oben auf das trockene Gerüst hinzu. Inkubieren Sie die Gerüste im Zellkulturinkubator bei 37 Grad Celsius für 45 bis 60 Minuten.
Entfernen Sie die Gerüste aus dem Inkubator. Die Gerüste sollten die Lösung während dieser Zeit vollständig absorbieren. Um die Proliferation zu induzieren, fügen Sie jedem Well vollständige Zellkulturmedien hinzu, die mit IL-7 und IL-15 ergänzt wurden.
IL-2 kann auch verwendet werden. Für ein 24-Well-Gerüst fügen Sie einen Milliliter hinzu. Für ein 48-Well-Gerüst fügen Sie 500 Mikroliter hinzu.
72 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die Zellen vermehren sich über die 72 Stunden, was das Medium orange färben kann. Entfernen Sie überschüssige Medien aus jedem Bohrloch.
Um Zellen aus dem Gerüst zu isolieren, fügen Sie 0,25 molare EDTA-Lösung zu jedem Gerüst hinzu. Fügen Sie einen Milliliter für 24-Well-Gerüste oder 300 Mikroliter für 48-Well-Gerüste hinzu. Lassen Sie den Teller sitzen oder rühren Sie ihn vorsichtig für drei bis vier Minuten.
Nach dem größten Teil aufgelöst pipetten Sie vorsichtig in den Brunnen. Ein paar Ein- und Ausspeiseschritte können notwendig sein, um das Gerüst vollständig aufzulösen. Die Lösung wird in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt.
Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Fügen Sie jedem Zentrifugenröhrchen 12 Milliliter PBS hinzu. Bei 400 g fünf Minuten zentrifugieren.
Am Boden des Röhrchens bildet sich ein Zellpellet. Die überstehende Lösung absaugen und die Wäsche wiederholen. Achten Sie darauf, den Überstand bei jeder Wäsche vollständig zu entfernen, da es wichtig ist, alle EDTA loszuwerden.
Nach einem zweiten Waschen mit PBS ist das Zellpellet bereit für die Analyse. Die Durchflusszytometrie wurde verwendet, um die Transduktionseffizienz jeder Gruppe zu bestimmen. Nicht transduzierte Zellen wurden als Negativkontrolle verwendet und zeigten keine Transduktion.
Zellen, die auf Gerüsten ohne GFP-Retrovirus ausgesät wurden, zeigten ebenfalls keine Transduktion. Die Drydux-Gruppe, die Zellen aktiviert hatte, die auf die trockenen makroporösen Alginatgerüste ausgesät waren, zeigte eine 85%ige Transduktion, knapp niedriger als die RetroNektin-Gruppe. Diese Ergebnisse zeigen, dass Drydux-Gerüste Zellen effektiv durch retroviralen Gentransfer transduzieren, ohne dass eine Spinokulation von RetroNectin-beschichteten Platten erforderlich ist.
Drydux-Gerüste weisen eine hohe Transduktionseffizienz auf, die mit RetroNectin vergleichbar ist und eine alternative Methode zur Transduktion von T-Zellen bietet. Aufgrund der niedrigen Herstellungskosten der Drydux-Gerüste hat dieses Verfahren das Potenzial, die Kosten für CAR-T-Zelltherapien deutlich zu senken.
