В этом протоколе описывается неинвазивный метод вызывания хронической боли в спине у мышей на срок до 10 недель, который может быть выполнен быстро и надежно с минимальным обучением. Самым сложным аспектом этой техники является распознавание ощущения от инъекции связки по сравнению с инъекцией в мышцу. Ощущение сопротивления при контакте указывает на инъекцию в связку.
Отсутствие сопротивления означает, что игла может находиться в мышце или брюшной полости. Для начала возьмите стерильную плоскую поверхность, чтобы поместить мышь. Затем поместите станцию восстановления грелки рядом с операционной установкой, чтобы немедленно перенести мышей после инъекции.
Далее подготовьте урокиназу и шприц Гамильтона. Нарисуйте раствор заранее, чтобы свести к минимуму время, которое мышь проводит под наркозом. После обезболивания мыши двумя пальцами найдите поясничные сегменты позвоночника на уровнях L2 и L3 ниже грудной клетки и проверьте место инъекции.
Поместите кончик шприца Hamilton рядом с позвоночником. Расположите шприц под углом примерно 45 градусов в связку, непосредственно прилегающую к кости. Осторожно, но плотно введите кончик иглы в связку и вводите медленно, пока не будут введены все пять микролитров.
Извлеките иглу осторожно и медленно. Затем поместите мышь в станцию рекуперации тепла, пока она не проснется и не станет подвижной. Наблюдайте за мышами в течение одного часа после операции, чтобы убедиться, что все нормальные двигательные функции продолжаются.
После операции ежедневно в течение недели проверяйте вес и место инъекции мышей, чтобы предотвратить инфекцию или осложнения. Перед тестированием переместите каждое животное в отдельный свободный бокс на испытательном столе с верхней ширмой. Затем стимулируйте подушечку стопы нитью фон Фрея 3,61, которая вызывает четыре грамма силы.
Снятие ногой трех-пяти раздражителей считается положительной реакцией. Теперь применяйте следующую, более слабую нить в серии, пока животное не перестанет реагировать на механическую стимуляцию. Используйте верхнюю нить накала до тех пор, пока не будет получена реакция, затем переключитесь обратно на нижнюю нить.
Используя алгоритм аппроксимации кривой, рассчитайте механический порог отвода, который представляет собой минимальное усилие, необходимое для получения ответной реакции в 50% случаев. Чтобы провести тест Харгривза, поместите мышей в кабинки на стеклянную поверхность, нагретую снизу инфракрасным излучателем. Измерьте время от воздействия инфракрасного света на заднюю лапу мыши до отведения в качестве задержки лапы.
Для теста с холодной пластиной поместите мышей на аппарат с холодной пластиной, охлажденный до минус девяти градусов по Цельсию. Запишите время, необходимое мыши, чтобы поднять ногу после того, как ее поместили на устройство, как задержку для отвода ноги. Чтобы выполнить тест на тревожность, поместите каждое животное в коробку для тестирования предпочтения места с проходом между двумя камерами.
Одна аппаратная камера должна быть ярко освещена, а противоположная сторона должна оставаться темной. С помощью компьютера следите за временем пребывания животного в свете и темноте и переходами в течение 10-минутного теста. Затем поместите модельных грызунов или наивных животных в нулевой лабиринт или воспользуйтесь двухкамерным тестом на предпочтение светлого или темного места.
Оцените время, проведенное на закрытых и открытых участках лабиринта, с помощью секундомера. Для теста на депрессию всплеска сахарозы распылите от 10 до 30% раствора сахарозы на дорсальный код и оцените частоту, продолжительность и латентность груминга в течение 10 минут. Чтобы провести тесты с новыми объектами, приучите мышей индивидуально к прозрачной пластиковой клетке с открытым верхом в течение одного часа.
Добавьте две одинаковые игрушечные мини-фигурки в противоположные углы клетки на пять минут. Акклиматизируйте животных в день тестирования в течение одного часа и поместите две одинаковые мини-фигурки в одни и те же положения клетки на пять минут, прежде чем вернуть их в домашнюю клетку. Затем замените одну из исходных фигур совершенно другим новым объектом.
Через четыре часа верните мышей в тестовую клетку и запишите время, затраченное на изучение объектов. Для оценки двигательной функции соорудите туннель из трубки от бумажного полотенца, разрезанной вдоль с одного края. Разложите открытый туннель на чистом листе бумаги для принтера.
Осторожно удерживайте мышей, пока они не успокоятся. Нанесите нетоксичные индийские чернила на лапы мыши, поместив их в чернильницу, штемпельную подушечку или ватную палочку. Выпустите мышей на входе в туннель.
Позвольте им пробежать через туннель и захватите их в конце. Оценивайте отпечатки лап на основе длины шага, ширины шага и разброса пальцев ног. Механический и термический анализы гиперчувствительности показали, что у мышей с хронической болью в спине значительно повысилась механическая, тепловая и холодовая чувствительность по сравнению с наивными контрольными группами.
Анализ тревожности показал, что общее время, проведенное в светлой камере светлого и темного ящика, и количество случаев поднятия на дыбы были значительно ниже у мышей с хронической болью в спине, что указывает на тревожность. Во время теста с сахарозой мыши с хронической болью в спине показали меньшее время груминга и количество груминга. Однако количество времени до начала груминга было значительно увеличено.
Длина шага между мышами с хронической болью в спине и наивными мышами значительно отличалась. Самое важное, что нужно помнить при попытке выполнить эту процедуру, это то, что вы нацелены на связки вокруг позвоночника, а не на мышцы. Модель хронической боли в спине предоставляет надежный инструмент для оценки различных новых исследований, фармакологических и других потенциальных терапевтических средств.
