Трифосфорилирование является повсеместной 5'-модификацией РНК в биологии и все чаще используется в биотехнологических приложениях. Протокол, описанный здесь, позволяет 5'трифосфорилирование любого олигонуклеотида, полученного стандартным автоматизированным синтезом. Химическое трифосфорилирование работает на олигонуклеотидах, содержащих РНК, ДНК или неестественную нуклеиновую кислоту.
Здесь трифосфорилированная левосторонняя L-РНК, энантиомер биологической D-РНК, синтезируется очищенной и используется в рибосомной реакции. Трифосфорилирование проводят после автоматизированного синтеза олигонуклеотидов и перед депротекцией. Эти шаги здесь не показаны, но исследователи должны быть знакомы со стандартными методами для обоих.
Для начала убедитесь, что рабочее пространство для фосфорилирования имеет газовый коллектор с не менее чем двумя линиями и барботер, соединенный с сухим источником аргона с регулируемым давлением, поскольку реакция трифосфорилирования должна выполняться под аргоном. Затем прикрепите один миллилитр пластиковых шприцев к линиям, чтобы облегчить соединение с реакционным аппаратом. Затем соберите оборудование, включающее в себя один миллилитр пластиковых шприцев, трехсторонний полипропиленовый запорный кран, некоринговые иглы, полипропиленовые трубки 1,5 миллилитра, небольшой металлический шпатель и храните их в герметичном контейнере или осушителе с осушителем при комнатной температуре в течение по крайней мере одного дня перед использованием.
Под давлением аргона вынимают 30 миллилитров безводного 1, 4-диоксана из герметичного флакона. Переложить в высушенный стеклянный флакон объемом 30 миллилитров и добавить сушильную ловушку. Уплотнить резиновыми перегородками и хранить в осушителе с осушителем.
Аналогично готовят 30 миллилитров N, N-диметилформамида, ацетонитрила и смесь трех частей диоксана и одной части пиридина по объему. Готовят раствор TBAP путем смешивания твердого пирофосфата трибутиламмония с диметилформамидом и трибутиламином в стеклянном флаконе емкостью 30 миллилитров, как описано в рукописи. Добавьте три ловушки рисования.
Запечатайте флакон резиновой перегородкой под аргоном и пузырите с аргоном в течение 30 минут. После получения олигонуклеотида со свободным 5'гидроксилом на колонке синтеза используют автоматизированный синтезатор ДНК/РНК. Подготовьте камеру, сняв поршень с сухого шприца в один миллилитр.
Отрежьте верхнюю часть шприца ножницами или лезвием бритвы и прикрепите шприц к колонне синтеза. К верхней части шприца прикрепите трехсторонний запорный кран и прикрепите боковое входное отверстие запорного крана к источнику сухого аргона с помощью барботера таким образом, чтобы верхнее входное отверстие запорного крана действовало как отверстие для впрыска реагента. Закрепите этих операторов на стойке с помощью зажимов и запечатайте все стыки вверх по течению восковой уплотнительной пленкой.
Затем отрегулируйте запорный кран так, чтобы порт впрыска был закрыт, а аппарат был открыт для источника аргона. Закройте барботер и дайте аргону при низком давлении течь через камеру действия в течение пяти минут. После повторного открытия барботера прикрепите шприц к нижней части колонны синтеза, который будет являться отработанным шприцем.
Затем протяните аргон через колонну несколько раз, используя шприц отходов, а затем снова прикрепите шприц с плунжером, полностью втолкнутым внутрь. Чтобы добавить реагент или растворитель, прикрепите иглу к сухому источнику аргона и вставьте ее в перегородку бутылки с реагентом или растворителем, следя за тем, чтобы не погрузить иглу в содержимое бутылки. Затем соберите сухой шприц с иглой и вставьте его в перегородку реагента или растворителя, не погружая его в содержимое бутылки.
После этого заполните шприц аргоном, выньте иглу из перегородки и изгоните аргон. После заполнения шприца аргоном и выталкивания еще раз заполните шприц необходимым объемом растворителя или реагента под давлением аргона. Отрегулируйте запорный кран так, чтобы источник аргона был закрыт, а порт впрыска открыт.
После того, как упор на аппарате будет быстро отрегулирован, извлеките заполненный шприц и иглу из исходного флакона, протрите любой растворитель, прилипший к боку или кончику иглы, а затем вставьте иглу в инъекционный порт. После введения реагента в антикамеру операторов извлеките иглу и закройте инъекционное отверстие, вновь открыв аппарат к источнику аргона. Осторожно вытяните жидкость из антикамеры через колонну синтеза с помощью шприца отходов, чтобы вся жидкость теперь удерживалась в шприце отходов.
Теперь медленно протолкните раствор обратно в колонну синтеза, гарантируя, что в колонне нет пузырьков газа. Чтобы перемешать или перемешать, осторожно потяните раствор вверх и вниз над колонкой со шприцем отходов. Чтобы удалить реагент или растворитель из колонны, медленно втяните раствор в шприц отходов.
После того, как основная часть раствора попала в шприц отходов, протяните аргон, чтобы смыть оставшийся растворитель из колонны. Далее снимите восковую уплотнительную пленку вокруг отработанного шприцевого соединения. Затем снимите шприц и выбросьте раствор отходов.
После этого замените отработанный шприц новым сухим шприцем и повторно запечатайте сустав. После сборки аппарата трифосфорилирования начните реакцию трифосфорилирования, добавив 200 микролитров пиридиндиоксана в антикамеру, как показано ранее. Но пока не тяните образец на колонну синтеза.
После растворения SalPCl в диоксане, как описано в рукописи, добавляют его в антикамеру и загружают на колонну синтеза с помощью сухого шприца. Затем дайте ему вступить в реакцию в течение 15 минут, а затем извлеките и выбросьте раствор SalPCl, используя шприц для отходов, как показано ранее. Сразу после удаления раствора SalPCl добавляют 250 микролитров раствора TBAP в антикамеру и загружают в колонну синтеза.
Дайте ему отреагировать 20 минут перемешиванием и выбросить, как описано ранее. После этого промывали колонну 0,5 миллилитра N, N-диметилформамида, затем 0,5 миллилитра ацетонитрила, удаляя растворитель после каждого добавления. После добавления раствора окислителя, его удаления и промывки колонки ацетонитрилом еще раз с помощью той же процедуры, которая показана, разберите аппарат и промывайте столб пятью миллилитрами ацетонитрила.
После этого высушите колонну. Отделить трифосфорилированный олигонуклеотид от твердой опоры и снять защиту с помощью стандартных протоколов, описанных в рукописи. Затем растворяют высушенный незащищенный олигонуклеотид в нагрузочном буфере мочевины, нагревают до 80 градусов Цельсия, затем нагружают на полиакриламидный гель и работают в течение одного-двух часов при 25-35 Вт.
В конце гелевого электрофореза, после снятия гелевой пластинки, разберите ее и заверните гель в поливинилхлоридную пленку. Затем определите полосы продукта путем обратного затенения 254-нанометровым ультрафиолетовым светом и иссечь основную полосу продукта с помощью лезвия бритвы. Измельчите иссеченный гель, выдавливая его через пластиковый шприц или механически.
Для олигонуклеотидов короче 15 нуклеотидов элюируют в три раза больший объем геля без нуклеазной воды в течение не менее 12 часов при перемешивании или встряхивании. Затем удаляют твердые кусочки геля, пропуская раствор через шприц, оснащенный фильтром 0,2 микрометра, и концентрируют путем лиофилизации. После концентрации удалите остаточные соли и салюты с помощью одноразовой колонки исключения размера и концентрат путем лиофилизации, как показано ранее.
После получения 10 микролитров раствора РНК, содержащего полимеразный рибозим и шаблон грунтовки L-РНК и трифосфатные тринуклеотиды, как описано в рукописи, отжиг его, нагревая до 90 градусов Цельсия в течение одной минуты и охлаждая до 23 градусов Цельсия при 0,2 градуса Цельсия в секунду в термоциклере ПЦР. После инкубации раствора РНК при 17 градусах Цельсия остановите реакцию, добавив 10 микролитров удвоенной концентрации стартового буфера по мере протекания реакции, возьмите 10 микролитровых аликвот и закалите пятью микролитрами 0,5 молярной ЭДТА при рН 8 и обработайте каждый образец для выделения РНК, как описано в рукописи. Растворите осажденную РНК в 10 микролитрах формализованного гелевого нагрузочного буфера и приготовьте непрореагировавшую концевую маркированную грунтовку, как описано в тексте.
Как только образцы будут подготовлены, нагрейте до 80 градусов по Цельсию. Загрузите пять микролитров образца в каждую скважину и запустите гель на 40 Вт в течение примерно 40 минут. После снятия гелевой пластины с подставки сканируйте с помощью флуоресцентного или фосфоресцентного гелевого сканера для визуализации перекрестных хиральных продуктов для расширения L-РНК.
После очистки геля УФ-затенение спины выявляет присутствие 5'трифосфата в качестве одного основного продукта, как показано для тримеров ДНК AAA и CCC и тримера GAA L-RNA. 5'гидроксильный побочный продукт часто виден как более медленная мигрирующая полоса, которая была выделена и идентифицирована масс-спектрометрией для тримеров ДНК. Дополнительные полосы во время очистки геля коррелируют с побочными продуктами 5'дифосфата, монофосфата и Н-фосфоната в масс-спектрометрии неочищенных продуктов реакции.
5'трифосфатные продукты показывают первичный пик массы, соответствующий 5'трифосфату вместе с 5'di и монофосфатными массами. Химически связанные с трифосфатом тринуклеотиды L-РНК использовались с праймером L-РНК и шаблоном L-РНК в реакции полимеризации РНК, проанализированной PAGE и визуализированной с помощью флуоресцентного гелевого сканера. Расширенный продукт, отмеченный черными кругами, продемонстрировал синтез L-РНК-версии рибозима молота, закодированного шаблоном.
Воздействие воды во время трифосфорилирования приведет к снижению урожайности. Следуйте инструкциям по приготовлению сухих реагентов и тщательной сборке реакционного аппарата. Медленно перемещайте жидкости через аппарат, чтобы избежать разрыва уплотнений.
Химическое трифосфорилирование необходимо для получения небиологических олигонуклеотидных трифосфатов, включая левостороннюю РНК. Это позволило синтезировать перекрестный хиральный рибозим зеркальных версий молекул РНК, обнаруженных в биологии.
