Мы разработали быстрый и эффективный протокол для генерации органоидов рака мочевого пузыря с помощью редактирования генов ex vivo нормальных уротелиальных клеток мыши, несущих флоксированные аллели в генах, представляющих интерес. Этот метод ex vivo имеет одно-двухнедельный рабочий процесс вместо многолетнего разведения мышей, и он очень эффективен в трансдукции аденовируса на cre-опосредованных генных делециях. Для начала подготовьте все стерильные инструменты и реагенты, включая ножницы, щипцы, DPBS в 35-миллилитровых культуральных блюдах, 70% этанол, марлю и чистые бумажные полотенца.
Далее очистите все поверхности области рассечения и накройте область рассечения чистым бумажным полотенцем. Поместите усыпленную мышь на марлю в области рассечения и распылите 70% этанола на брюшко мыши, затем, используя стерильные ножницы для рассечения, сделайте нижний средний разрез брюшной полости, чтобы обнажить мочевой пузырь. Теперь используйте щипцы, чтобы схватить и осторожно подтянуть мочевой пузырь, чтобы определить двустороннее мочеточниковое соединение.
С помощью ножниц удалите глазное дно мочевого пузыря, следуя пограничной линии между двумя отверстиями мочеточника и переместите мочевой пузырь в стерильную посуду, содержащую 2 миллилитра DPBS, затем удалите жировую и соединительную ткань и поместите мочевой пузырь в новую посуду, содержащую 2 миллилитра DPBS. Также удалите аденовирус из минус 80-градусного хранения по Цельсию и держите его на льду. Для диссоциации клеток подготовьте все стерильные инструменты и реагенты, как описано в рукописи, затем в шкафу биобезопасности перенесите мочевой пузырь в 35-миллиметровую посуду и вымойте 2 миллилитрами стерильного DPBS.
Соберите ткани мочевого пузыря от четырех мышей в чашку с одним миллилитром полной питательной среды без удаления древесного угля FBS. Затем, используя хирургический клинок, измельчите каждый мочевой пузырь на четыре равные части, затем, используя щипцы, разверните мочевой пузырь, чтобы обнажить поверхность уротелия для среды. Переместите кусочки мочевого пузыря и среду в 15-миллилитровую центрифужную трубку.
Дважды вымойте посуду 2 миллилитрами полной питательной среды без очищенного от древесного угля FBS и добавьте промывку в трубку центрифуги, доведя общий объем до 5 миллилитров. Затем добавьте смесь коллагеназы и гиалуронидазы и поместите трубку горизонтально в орбитальный шейкер-инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия в течение 30 минут при 200 оборотах в минуту. После переваривания тканей добавьте равный объем 10% очищенных от древесного угля FBS и DPBS в пробирку и центрифугу по 200 раз в г в течение 5 минут.
После выброса супернатанта добавьте 2 миллилитра заменителя трипсина в ячейку гранулы и хорошо перемешайте, затем инкубируйте трубку при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 4 минут. После инкубации пипеткой клетки вверх и вниз 10 раз с помощью стандартного наконечника P1000 и добавьте 5 миллилитров 10% очищенных от древесного угля FBS и DPBS. Процедите диссоциированные клетки через 100-микрометровый стерильный клеточный сетчатый фильтр и соберите клеточную суспензию в 50-миллилитровую трубку.
Переложите клеточную суспензию в 15-миллилитровую трубку и центрифугу по 200 раз в г в течение 5 минут. После удаления супернатанта повторно суспендируют гранулу в 1 миллилитре полной питательной среды. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра и пластины 0,5 раза 10 до 6-й клетки в каждую лунку из 24-луночной пластины с 0,5 миллилитрами свежей полной питательной среды.
Далее вынимаем матричные экстракты клеток саркомы мыши Энгельбрета-Холма-Роя из хранилища минус 20 градусов Цельсия и размораживаем их на льду. Также предваряют 6-луночную пластину в клеточном инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия. Для аденовирусной трансдукции добавьте 2 микролитра аденовируса в 24-луночную пластину и хорошо перемешайте с диссоциированными уротелиальными клетками.
Для повышения эффективности трансдукции выполняют спинокуляцию путем центрифугирования пластины в 300 раз в г в течение 30 минут, затем инкубируют пластину при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 1 часа. Перенесите ячейки и среду из скважины в 15-миллилитровую трубку и центрифугу по 200 раз в г в течение 5 минут. После выбрасывания надосадочного вещества добавляют 50 микролитров полной питательной среды и хорошо перемешивают с клетками на дне.
Затем добавьте 140 микролитров экстракта матрицы и аккуратно хорошо перемешайте, чтобы избежать пузырьков воздуха, затем создайте купола для органоидов, быстро добавив 50 микролитров раствора на купол в предварительно расплавленную 6-луночную пластину. Инкубируйте плиту и дайте куполам затвердеть в течение 5 минут. Через 5 минут переверните 6-луночную пластину вверх дном и продолжайте затвердевание в течение дополнительных 25 минут.
После инкубации добавляют в каждую лунку по 2,5 миллилитра полной питательной среды и помещают пластинку в инкубатор для органоидной культуры. Зеленый флуоресцентный белок был обнаружен почти в 100% клеток, что свидетельствует о высокой эффективности трансдукции аденовируса. Окрашивание гематоксилина и эозина и иммуногистохимия опухолей тройных нокаутных органоидов показали морфологию полноценной уротелиальной карциномы с положительной экспрессией белка маркеров базального подтипа CK5 и p63.
Нерекомбинированные флокированные аллели были обнаружены в уротелиальных клетках, не обработанных аденовирусом, тогда как рекомбинированные аллели наблюдались в тройных нокаутных органоидах. В целом, для формирования 2-сантиметровой подкожной опухоли требовалось от 2 до 3 недель. Иммуногистохимия тройных нокаутных органоидов, in vivo ксенотрансплантатов, показала положительную экспрессию белков CK7, CK5 и p63.
Обнаружена отрицательная экспрессия белков CK8 и уроплакина. Маркер мезенхимы, виментин, был обнаружен только в опухолевой капсуле или строме. Диссоциация мочевого пузыря мыши не должна превышать 30 минут.
Более длительное время диссоциации может увеличить процент клеток стромы, таких как эндотелиальные клетки и фибробласты Этот подход может быть объединен с сортировкой клеток или клеточным типом специфического аденовируса для генерации клеточного типа специфических органоидов, таких как просвет по сравнению с базальными органоидами.
