Опухолевые органоиды широко используются в качестве модели рака in vitro для изучения биологии опухолей. Наш протокол обеспечивает подробную процедуру изоляции, культуры и генетически манипулировать органоидами опухоли мочевого пузыря, выступающей в качестве важного инструмента для изучения различных аспектов в биологии рака. Используя наш протокол, мы можем генетически манипулировать органоидами опухоли мочевого пузыря, чтобы выразить или выбить ген нашего интереса.
Кроме того, с помощью нашего метода ортотопической трансплантации, мы можем создать нетронутую опухоль микроокноронии опухолевых органоидов. Демонстрацией процедуры будет юбин Ким, аспирант нашей лаборатории. Начните с установления органоидов опухоли мочевого пузыря из опухоли мочевого пузыря.
Добавьте один миллилитр 10 миллимолярной HEPES в DMEM к фрагментам опухоли и измельчите ткань стерилизованным лезвием бритвы. Чтобы разобщить фрагменты в клеточную суспензию, добавьте девять миллилитров DMEM с HEPES, коллагеназы типа один и два, и термолизин к опухолевым частям, и инкубировать их в течение 1,5 до двух часов при 37 градусах цельсия и 5%углекислого газа на орбитальном шейкере. После инкубации перенесите подвесную клетку в 50-миллилитровую трубку.
Центрифуга трубки в 400 раз г в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию и аспирировать супернатант. Resuspend гранулы в пять миллилитров ACK лизай буфера и инкубировать трубку при комнатной температуре в течение трех-пяти минут, чтобы вынизыть любые красные кровяные тельца. Между тем, пальто хорошо в 24-хорошо пластины с 150 микролитров ледяного фактора роста снижение мембранной матрицы подвала и поместите пластину в инкубатор в течение 30 минут.
Добавьте 20 миллилитров DMEM в трубку с клетками и повторите центрифугу. Аспирировать супернатант и повторно процедить гранулы в один миллилитр 0,25%трипсина ЭДТА и 10 микромолейных Y-27632 дигидрохлорида. Инкубировать трубку в течение пяти минут в 37 градусов по Цельсию водяной бане.
Затем нейтрализуем трипсин, добавив 10 миллилитров DMEM с 10%FBS. Фильтровать подвеску клетки через 100 микрометровый клеточный ситечко на новой 50-миллилитровой трубке для удаления непереваренного мусора. Центрифуга трубки в 400 раз г в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию и аспирировать супернатант.
Затем повторно посчитайте гранулы одним миллилитром DMEM и подсчитайте клетки с гемоцитометром. Перенесите три-четыре раза по 10 четырем опухолевым клеткам на микротрубки 1,5 миллилитров на льду и центрифуга в 400 раз г в течение трех минут при четырех градусах Цельсия. Тщательно удалите супернатант и повторно поместите клетки в 500 микролитров довоенной органоидной среды и 10 микромоляров Y-27632.
Перенесите подвесную оболочку в ранее подготовленную мембранную матрицу, покрытую хорошо, и поместите 24-хорошую пластину обратно в инкубатор. Замените среду каждые два дня 500 микролитров довоенной органоидной среды. Разделите органоиды опухоли за 12 часов до постивирусной опосредованной трансдукции.
На следующий день, быстро оттаивать вирус, содержащий aliquot в 37 градусов по Цельсию водяной бане. Добавьте оттаявный вирус в 250 микролитров органоидной среды с 10 микромоляными Y-27632 и восемью микрограммами на миллилитр бромистого гексадиметрина. Замените органоидную среду в 24-хорошо пластины с 500 микролитров вируса, содержащего средний и инкубировать пластины в течение 12 до 16 часов при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа.
Для подготовки органоидов опухоли мочевого пузыря для ортотопической трансплантации добавьте 500 микролитров коллагеназы в органоидную среду в 24-хорошо пластины. Pipette матрицы мембраны подвала и средних вверх и вниз, то инкубировать пластины в течение 20 минут при 37 градусов по Цельсию. После инкубации, собрать клетки в 15 миллилитров трубки и добавить пять миллилитров предварительной DMEM.
Затем центрифуга трубки в 400 раз g в течение трех минут при четырех градусах Цельсия и аспирировать супернатант. Переусердуйте гранулы с помощью одного миллилитра DMEM и перенесите раствор в 90-миллиметровую чашку Петри. Под микроскопом, забрать от 10 до 100 опухолевых органоидов с P200 пипетки и собирать их в микротрубки на льду.
Центрифугайте микротрубку и аккуратно удалите супернатант. Затем поддерживать гранулы на льду, пока мыши не будут готовы к операции. Перед пересадкой стенки субмукоза мочевого пузыря держите шприцы, наконечники пипеток и мембранную матрицу подвала на льду до готовности к использованию.
После того, как мышь была анестезирована, положите ее в положение на спине и поддерживайте анестезию путем вдыхания маски 2%vaporized isoflurane. Нанесите йод повидоне стерильной марлей и протрите его 70%этанолом. Сделайте небольшой поперечный разрез в коже и мышечной стенке нижней части живота средней линии с помощью стерильных хирургических ножниц.
Выставить мочевой пузырь из брюшной полости и поддержать его солевым пропитанным ватным тампоном. Повторное использование органоидных гранул в 80 микролитров органоидной среды, содержащей 50%-ную концентрацию мембранной матрицы, и впрыскивает суспензию в передний аспект купола мочевого пузыря с помощью инсулинового шприца. Закройте разрез 4-0 нейлоновым швом и дезинфицировать хирургическое отделение йодом повидона и 70%этанолом.
Позвольте мыши восстановиться под инфракрасным облучением в течение 10-15 минут. Затем снова следите за мышью, пока она не приходит в сознание. Опухолевые органоиды мышей были созданы и культуры в течение девяти дней.
Если опухолевые клетки не образуют органоиды опухоли, они потенциально были убиты во время шага диссоциации и время энзиматических пищеварения, возможно, потребуется настроить. Органоиды опухоли мочевого пузыря продемонстрировали сильные сигналы GFP с успешной лентивирусной инфекцией. После концентрации, в общей сложности 250 микролитров вируса, содержащего средства массовой информации было достаточно, чтобы заразить 30000 одиночных опухолевых клеток на мембранной матрице подвала и поддерживать от 90 до 100% эффективности инфекции.
Алографы опухоли мочевого пузыря были собраны через три недели после ортотопической трансплантации, а гистология опухоли была проанализирована с помощью окрашивания H и E. Ортопедические трансплантации опухолевых органоидов могут расти как опухоли мочевого пузыря в течение двух-трех недель. После этой процедуры, исследователи могут выполнять иммуногистохимии в результате опухолевых органоидов или провести количественные RT-PCR для генов, представляющих интерес.
Эти эксперименты могут еще больше охарактеризовать опухолевые органоиды. Наш протокол позволяет нам манипулировать генами в раковых клетках легко по сравнению с моделью мыши, сохраняя при этом виво характеристики опухолей для того, чтобы изучить конкретные функции различных генов, участвующих в tumorigenesis рака мочевого пузыря.
