Наш протокол описывает, как построить стимулированную комбинационную рассеянную микроскопию, которая позволяет измерять вибрационный спектр молекул в течение микросекунд. И при применении к визуализации он может обеспечить гиперспектральную микроскопию для локализации и количественной оценки химических компонентов вещества без маркировки и неинвазивным способом. Существует несколько применений этого протокола, в основном в биологических и биомедицинских науках.
Например, для изображения клеток или тканей. В нашем подходе есть две важные проблемы: широкополосный оптический источник и цепочка обнаружения. Чтобы решить первую проблему, можно приобрести OPR или построить ее самостоятельно.
В качестве альтернативы можно использовать суперконтинуум белого света, генерируемый в объемных кристаллах или в нелинейных оптических волокнах. Последняя проблема может быть решена путем последовательного сканирования каждого спектрального компонента с помощью коммерческого фотодиода и сканера galvo Для начала извлеките два микролитра из водной суспензии полиметилметакрилата или микрошариков ПММА и вылейте суспензию на крышку микроскопа. Затем извлеките два микролитра из водной суспензии полистирольных микрошариков и соедините ее со суспензией ПММА на крышке.
Аккуратно смешайте суспензию с наконечником пипетки и дайте ей высохнуть в течение 24 часов. Белый слой бусин появится поверх крышки, когда вода высохнет. Добавьте 20 микролитров диметилсульфоксида и 20 микролитров чистого оливкового масла поверх крышки.
И нанесите лак для ногтей на края второго микроскопа крышки. Положите крышку на смесь лаком для ногтей вниз и приложите достаточное давление, чтобы запечатать ее. Дайте высохнуть.
Оптимизировать эффективность модуляции узкополосного луча Стокса. Измените расстояние между объективами F1 и F2 и измерьте модулированный луч с помощью фотодиода. Затем запишите его профиль с помощью осциллографа.
Отрегулируйте длину полости оптического параметрического генератора таким образом, чтобы полученный широкополосный спектр насоса вместе с узкополосным Стоксом на 1040 нанометров мог производить расстройку частоты в пределах от 2 800 до 3 100 обратных сантиметров. Этот спектральный диапазон охватывает колебания области растяжения CH. Отправьте широкополосный насос в призменный компрессор, чтобы компенсировать дисперсионные эффекты, включенные объективом микроскопа возбуждения.
Введите насос в призму А через его вершину и направьте дисперсный насос к вершине призмы В. Определите необходимое количество отрицательной дисперсии и установите расстояние между вершинами призм соответственно. Используйте резные призмы Брюстера и убедитесь, что поляризация пучка насоса лежит в треугольных плоскостях призм. Чтобы оптимизировать встроенную сбалансированную схему обнаружения, установите быструю ось этого двулучепреломляющего кристалла вертикально и направьте поляризованный насос на пластину YV04 длиной 13,3 миллиметра.
Затем используйте полуволновую пластину, чтобы установить поляризацию пучка насоса на 45 градусов. Объедините насос и балки Stokes с дихроичным зеркалом и тщательно выровняйте их с помощью пары флуоресцентных точечных отверстий. Убедитесь, что оба луча распространяются совместно линейно.
Ослабьте лучи и направьте их на быстрый фотодиод, чтобы временно перекрыть их. После этого удалите фотодиод. Затем измерьте профили луча с помощью калиброванной камеры и используйте инфракрасную карту для оценки диаметров на глаз.
Используйте два телескопа. Один для насоса, а другой для балки Стокса, и попытайтесь сопоставить диаметры луча с задним отверстием объекта возбуждения. Как только будет получено стимулированное комбинационное рассеяние, или сигнал SRS, используйте телескоп на пучке насоса, чтобы настроить его диаметр, изменяя его диапазон Рэлея и, следовательно, объем взаимодействия в фокусе микроскопа.
Остановитесь, когда будет достигнут максимальный SRS. Используйте фотодиод для измерения интенсивности пучка насоса и с учетом чувствительности фотодиода рассчитайте среднюю мощность, влияющую на активную область детектора. Чтобы измерить относительную интенсивность шума лазера, отключите фильтр нижних частот и подключите выход фотодиода с высокой пропускной способностью к входу блокирующего усилителя.
Храните блокирующий выход в вольтах над квадратным корнем герца на разных частотах демодуляции и используйте чувствительность фотодиодов для преобразования вольт в ватты. Направьте насос и пучки Стокса к микроскопу. Поместите образец и найдите область без бусин, чтобы помочь выровнять балку насоса.
Затем сделайте цели возбуждения и сбора конфокальными. Поставьте фильтр короткого прохода, чтобы удалить модулированный Стокс и направить пучок насоса к сортировке. Поместите линзу после градации, чтобы сфокусировать рассеянный луч на детекторах.
Для сбалансированного обнаружения измерьте спектр опорного и сигнальных реплик, распространяющихся вдоль пучка насоса. Поместите небольшую щель или радужную оболочку между грейдингом и поляризационным делителем пучка, чтобы гарантировать спектральное соответствие между двумя матрицами фотодиодов и пространственно отфильтровать дисперсный насос. Обрежьте все, кроме одного спектрального компонента реплик насоса, чтобы центрировать передаваемые лучи на N-м детекторе опорных и сигнальных фотодиодных матриц.
Используйте зеркала рулевого управления для регулировки корреляции различных каналов обнаружения. Чтобы начать микроскопию SRS: модулируйте Стокса, растровое сканирование образца и получите передачу модуляции в спектре насоса с соответствующим спектром постоянного тока, чтобы получить нормализованный спектр SRS из каждого пикселя. Создание трехмерных матриц, строки и столбцы которых содержат отсканированные положения образца.
На каждом векторе, ортогональном плоскости XY, храните спектр SRS. Построение диаграммы концентрации и спектральных профилей для получения химических изображений и характерных спектров химических составляющих образца. Репрезентативное изображение показывает спектры шума относительной интенсивности оптических источников, используемых в этом протоколе.
Здесь показана лучшая спектральная область для экспериментов SRS. Модуляция луча Стокса на любой частоте в пределах этой полосы гарантирует, что воздействие лазерного шума на сигнал SRS будет минимально возможным. Здесь приведены примерные данные несбалансированных и сбалансированных спектров.
Эффекты сбалансированного обнаружения влияют на конечные результаты экспериментов. А именно, химические карты. Композиционные изображения в несбалансированных и сбалансированных условиях показаны здесь.
Репрезентативные изображения показывают хемометрический анализ гиперспектральных данных SRS. Здесь показаны составные карты концентраций различных химических составляющих образца и их характерных спектров SRS. Из этих данных можно легко идентифицировать различные составляющие образца, например, оливковое масло, полистирол DMSO и полиметилметакрилат.
В настоящее время наша техника может только зондировать растяжение вибрации CH. Однако, оптимизируя оптический источник, та же цепочка обнаружения позволит нам исследовать более информативную область отпечатков пальцев, обнаруживая сразу несколько режимов. Наша цепочка обнаружения прокладывает путь для интеграции широкополосных SRS в клиники, внедряя технологию, которая дополнит и улучшит традиционный рабочий процесс гистопатологии для диагностики тканей.
