Этот протокол обеспечивает выгодную стратегию обогащения стволовых клеток слезной железы для регенерации и реконструкции слезной железы. Стволовые клетки слезной железы демонстрируют долгосрочную способность к расширению и потенциал дифференцировки. Основным преимуществом этого метода является то, что культуральная среда для стволовых клеток слезной железы не содержит сыворотки, что показывает огромную ценность для восстановления слезной железы Начните с получения усыпленной шести-восьминедельной мыши BALB / c и разрезания кожи за ухом, чтобы обнажить слезную железу и соединительную ткань вокруг нее.
Отшелушить соединительную ткань тупым рассечением с помощью пинцета и удалить слезную железу. Погрузить слезные железы в шестисантиметровую посуду с четырьмя миллилитрами 75%-ного этанола на 10 секунд и сразу же дважды промыть 10-миллимолярным раствором PBS. Разрежьте слезные железы на мелкие фрагменты размером около одного миллиметра в кубиках.
Переложите их в стерильную 15-миллилитровую центрифужную трубку и обработайте ткани 500 микролитрами по 25 единиц на миллилитр диспазы и 500 микролитрами 0,1% коллагеназы I в течение одного часа при 37 градусах Цельсия. Обработать фрагменты слезной железы одним миллилитром 0,05% трипсина ЭДТА в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия и диссоциировать фрагменты на отдельные клетки путем многократного пипетирования. Отфильтруйте суспензию через 70-микрометровый фильтр, соберите фильтр в стерильную 15-миллилитровую центрифужную трубку и центрифугу в 150 раз больше G в течение пяти минут.
После центрифугирования удаляют супернатант, добавляют 10 миллилитров 10-миллимолярного раствора PBS для промывки ячейки гранулы и центрифугируют суспензию в 150 раз G в течение пяти минут. Повторите промывку ячейки гранулы. Затем удалите супернатант и добавьте один миллилитр соотношения 1:1 модифицированных орлов Dulbecco Medium и F-12 Хэма, чтобы повторно суспендировать гранулы клеток.
Добавьте 20 микролитров матричного геля слезной железы со средой стволовых клеток в центре лунки из 24-луночной пластины. Используйте наконечник пипетки, чтобы расширить его до круга диаметром от шести до восьми миллиметров и инкубировать смесь в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия, чтобы предварительно покрыть лунку. Используйте счетчик клеток для определения количества клеток и добавьте 40 микролитров среды стволовых клеток слезной железы, или LGSCM, в общей сложности 10 000 клеток в 40 микролитров матричного геля.
Аккуратно смешайте их с пипеткой. Используйте пипетку, чтобы осторожно капнуть 80 микролитров смеси на предварительно покрытую область в каждой лунке 24-луночной пластины. Инкубировать смесь в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия и добавить 600 микролитров LGSCM.
Меняйте культуральную среду в каждой лунке один раз в два дня. После семи дней посева ищите сферы LGSC диаметром от 100 до 300 микрометров под инвертированным микроскопом. Используйте этот протокол для выделения и культивирования первичных стволовых клеток слезной железы мышей Rosa26 и NOD.
После семи дней культивирования хорошо уберите культуральную среду из сферы культуры. Дезагрегировать сферы LGSC путем инкубации в 20 микролитрах по 10 единиц на миллилитр диспазу и 100 микролитрах 10-миллимолярной PBS в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия. Перенесите суспензию в 15-миллилитровую центрифужную трубку и центрифугу при 150 G в течение четырех минут.
Удалите супернатант. Обработайте сферы одним миллилитром 0,05% трипсина ЭДТА в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия Добавьте один миллилитр 0,05% ингибитора трипсина и пипетку многократно, чтобы нейтрализовать трипсин и диссоциировать сферы на одиночные клетки. Центрифугируйте в 150 раз G в течение пяти минут и удалите супернатант для гранулирования LGSC.
Добавьте один миллилитр LGSCM, чтобы повторно суспендировать гранулу стволовых клеток слезной железы и пластинчатость клеток, как было продемонстрировано ранее. При выполнении первой процедуры удлиняют время культивирования ЛГСК с семи до 14 дней с помощью системы культивирования стволовых клеток слезной железы для случайной дифференцировки. Для второй процедуры измените отношение матричного геля к LGSCM с 1:1 до 1:2 в начале культуры стволовых клеток слезной железы для дифференцировки протоковых клеток.
Посейте стволовые клетки слезной железы в матрицу для индукции в течение 14 дней. Для третьей процедуры, после прохождения, замените LGSCM на LGSCM 10% FBS для дифференцировки ацинарных клеток. Вызывают дифференциацию в течение 14 дней.
После одной недели культивирования Kr14 и Ki67 экспрессировались во всех сферах, образованных стволовыми клетками слезной железы. Сферы достигали диаметра 100 микрометров. Окрашивание гематоксилином и эозином показало клеточность на седьмой день.
Факторы обогащения стволовых клеток слезной железы, полученные после семи дней первичной культуры и субкультуры, указывали на то, что клетки, обогащенные этим методом, обладали сильной пролиферативной способностью. В этой системе стволовые клетки слезной железы могут проходить более 40 раз и при этом сохранять характеристики стволовых клеток. Стволовые клетки слезной железы были индуцированы с образованием большего количества почек фетальной бычьей сывороткой и низкой долей матричного геля.
Окрашивание гематоксилином и эозином указывало на то, что фетальная бычья сыворотка может индуцировать сферы для производства большего количества кавитирующих структур. После ортотопической инъекции стволовых клеток слезной железы Rosa у мышей NOD рядом со слезными железами образовались новые слезные дольки. Большинство долек состояли из зрелых ацинарных клеток с высокой экспрессией AQP5 и имели внутридольковое образование протоков с низкой экспрессией AQP5.
Количество слезной секреции на стороне инъекции стволовых клеток слезной железы Розы было выше, чем на контрольной стороне, но ниже, чем у мышей дикого типа Матричный гель и связанная с ним смесь всегда должны храниться на льду перед использованием, а микроцентрифужная трубка и наконечники, контактирующие с матричным гелем, должны быть предварительно охлаждены. Система обеспечивает идеальную модель для дальнейшего изучения стволовых клеток слезной железы, восстановления слезных желез и скрининга лекарств на заболевания слезных желез.
