מערכת תרבית תלת-ממדית, ללא סרום, לתאי גזע של בלוטת הדמעות

פרוטוקול זה מספק אסטרטגיה מועילה להעשרת תאי גזע של בלוטת הדמעות לצורך התחדשות ושחזור של בלוטת הדמעות. תאי גזע של בלוטת הדמעות מראים יכולת התרחבות ארוכת טווח ופוטנציאל התמיינות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדיום התרבית לתאי גזע של בלוטת הדמעות הוא נטול סרום, מה שמראה את הערך העצום לתיקון בלוטת הדמעות בגין על ידי קבלת עכבר זכר BALB/c בן שישה עד שמונה שבועות מורדם וחתך העור מאחורי האוזן כדי לחשוף את בלוטת הדמעות ואת רקמת החיבור סביבו.

מקלפים את רקמת החיבור על ידי דיסקציה קהה בעזרת פינצטה ומסירים את בלוטת הדמעות. לטבול את בלוטות הדמעות בצלחת של שישה סנטימטרים עם ארבעה מיליליטרים של 75% אתנול למשך 10 שניות ולשטוף מיד עם תמיסת PBS 10 מילימולרית פעמיים. חותכים את בלוטות הדמעות לרסיסים קטנים של כמילימטר אחד.

מעבירים אותם לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מיליליטר ומטפלים ברקמות עם 500 מיקרוליטרים של 25 יחידות למיליליטר דיספוזה ו-500 מיקרוליטרים של 0.1% קולגן I למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס. טפל בשברי בלוטת הדמעות עם מיליליטר אחד של 0.05%טריפסין EDTA למשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ונתק את השברים לתאים בודדים על ידי צנרת שוב ושוב. מסננים את ההשעיה דרך מסנן של 70 מיקרומטר, אוספים את המסנן לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מיליליטר, וצנטריפוגה ב-150 פעמים G למשך חמש דקות.

לאחר צנטריפוגה, הסר את הסופרנאטנט, הוסף 10 מיליליטרים של תמיסת PBS 10-millimolar כדי לשטוף את גלולת התא, וצנטריפוגה את המתלים ב 150 פעמים G במשך חמש דקות. חזור על שטיפת גלולת התא. לאחר מכן, הסר את הסופרנאטנט והוסף מיליליטר אחד של יחס של 1:1 של מדיום הנשרים המהונדסים של דולבקו וה-F-12 של האם כדי לבצע החייאה של כדורי התא.

הוסיפו 20 מיקרוליטרים של מטריצה ג'ל בלוטת הדמעות של מטריצה מטריצה בינונית של תאי גזע במרכז הבאר של צלחת של 24 בארות. השתמשו בקצה פיפטה כדי להרחיב אותה למעגל בקוטר של כשישה עד שמונה מילימטרים ולדגום את התערובת במשך 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס כדי לצפות מראש את הבאר. השתמש במונה תאים כדי לקבוע את מספר התאים ולהוסיף 40 מיקרוליטרים של מדיום תאי גזע של בלוטת הדמעות, או LGSCM, עם סך של 10, 000 תאים לתוך 40 מיקרוליטרים של ג'ל המטריצה.

מערבבים אותם בעדינות עם פיפטה. השתמשו בפיפטה כדי להפיל בזהירות 80 מיקרוליטרים של התערובת על האזור המצופה מראש בכל באר של הצלחת בת 24 הבארות. דגירה של התערובת למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והוספת 600 מיקרוליטרים של LGSCM.

שנה את המדיום התרבותי בכל באר פעם ביומיים. לאחר שבעה ימים של תרבית, חפש כדורי LGSC בקוטר של 100 עד 300 מיקרומטר מתחת למיקרוסקופ ההפוך. השתמש בפרוטוקול זה כדי לבודד ולתרבת תאי גזע ראשוניים של בלוטת הדמעות של עכברי Rosa26 ו- NOD.

לאחר שבעה ימים של תרבות, הסר את המדיום התרבותי מתרבות המרחב היטב. פרקו את כדורי ה-LGSC על ידי דגירה ב-20 מיקרוליטרים של 10 יחידות למיליליטר ו-100 מיקרוליטרים של PBS 10-מילימולרי למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. מעבירים את המתלים לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב-150 פעמים G למשך ארבע דקות.

הסר את ה-supernatant. טפלו בכדורים עם מיליליטר אחד של 0.05%טריפסין EDTA למשך חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס הוסיפו מיליליטר אחד של מעכב טריפסין של 0.05% טריפסין ופיפטה שוב ושוב כדי לנטרל את הטריפסין ולנתק את הכדורים לתאים בודדים. צנטריפוגה ב 150 פעמים G במשך חמש דקות ולהסיר את supernatant כדי גלולה LGSCs.

הוסיפו מיליליטר אחד של LGSCM כדי להחיות את גלולת תאי הגזע של בלוטת הדמעות ולצלוח את התאים כפי שהוכח קודם לכן. אם מבצעים הליך אחד, האריכו את זמן התרבית של ה- LGSCs משבעה ל -14 יום עם מערכת תרבית תאי הגזע של בלוטת הדמעות להתמיינות אקראית. עבור הליך שני, שנה את היחס בין ג'ל המטריצה ל- LGSCM מ- 1:1 ל- 1:2 בתחילת תרבית תאי הגזע של בלוטת הדמעות לצורך התמיינות של תאי צינור.

זרעו את תאי הגזע של בלוטת הדמעות לתוך המטריצה לצורך אינדוקציה למשך 14 יום. עבור הליך שלישי, לאחר המעבר, החלף את ה- LGSCM ב- LGSCM 10% FBS להתמיינות של תאים אסינאריים. לגרום להבחנה במשך 14 יום.

לאחר שבוע אחד של תרבית, Kr14 ו- Ki67 באו לידי ביטוי בכל הכדורים שנוצרו על ידי תאי גזע של בלוטת הדמעות. הכדורים הגיעו לקוטר של 100 מיקרומטר. ההמטוקסילין והכתמים של אאוזין הראו את התאים ביום השביעי.

גורמי ההעשרה של תאי גזע של בלוטת הדמעות שהתקבלו לאחר שבעה ימים של תרבית ראשונית ותת-תרבות הצביעו על כך שהתאים שהועשרו בשיטה זו היו בעלי יכולת התפשטות חזקה. במערכת זו, תאי גזע של בלוטת הדמעות יכולים לעבור למעלה מ-40 פעמים ועדיין לשמור על מאפייני תאי הגזע. תאי גזע של בלוטת הדמעות הושרו ליצור יותר ניצנים על ידי סרום בקר עוברי ושיעור נמוך של ג'ל מטריקס.

צביעת המטוקסילין ואאוזין הצביעה על כך שסרום בקר עוברי יכול לגרום לכדורים לייצר יותר מבנים מחלחלים. לאחר הזרקה אורתוטופית של תאי גזע של בלוטת הדמעות רוזה בעכברי NOD, נוצרו אונות דמעות חדשות בצמוד לבלוטות הדמעות. רוב הלובולים היו מורכבים מתאים אסינאריים בוגרים עם ביטוי גבוה של AQP5 והייתה היווצרות צינורות אינטראוליים עם ביטוי AQP5 נמוך.

כמות הפרשת הדמעות בצד הזרקת תאי הגזע של בלוטת הדמעות רוזה הייתה גבוהה יותר מאשר בצד הבקרה, אך נמוכה יותר מאשר בעכברים מסוג בר ג'ל המטריצה והתערובת הקשורה אליו חייבים תמיד להישמר על קרח לפני השימוש ויש לקרר מראש את צינור המיקרוצנטריפוגה והקצות במגע עם ג'ל מטריקס. המערכת מספקת מודל אידיאלי למחקר נוסף של תאי גזע של בלוטת הדמעות, תיקון בלוטת הדמעות ובדיקת תרופות למחלות בלוטות הדמעות.