Этот протокол важен, поскольку он не только демонстрирует подходы к очистке везикул от культуры в различных масштабах, компромиссы, различия между методологиями, а также рассмотрение работы с полевыми образцами. Цианобактерии представляют собой уникальные проблемы для отбора проб и анализа пузырьков. Эти методы успешно изолировали и концентрировали везикулы из культуры и из образцов окружающей среды.
Чтобы сконцентрировать образцы объемом менее 500 миллилитров, начните с промывки 15-20-миллилитров ультрафильтрационных центробежных концентраторов сверхчистой водой типа 1. Загрузите концентраторы в центрифугу и вращайте при 4 400 х г при четырех градусах Цельсия. Отбросьте прогон и повторите шаг по крайней мере дважды.
Загрузите образец супернатанта в концентратор, промытый водой, и вращайте его в тех же условиях. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока образец не будет сконцентрирован до конечного объема от 15 до 30 миллилитров. Чтобы сконцентрировать объем более 500 миллилитров, выполните тангенциальную фильтрацию потока, настроив аппарат, как описано в рукописи.
Прикрепите перистальтический насос к впускной линии и установите регулируемые зажимы на ретентационную линию. Продезинфицируйте тангенциальную фильтрацию потока, как описано в рукописи, затем промыть устройство одним литром сверхчистой воды типа 1. Добавьте в резервуар для проб менее 0,2 микрона фильтрата.
Медленно увеличивайте скорость насоса и уровни противодавления на ретентатной линии, чтобы увеличить производительность фильтратных линий. Продолжайте проводить тангенциальную фильтрацию потока и заполняйте резервуар питательным наполнителем по мере удаления материала. Прекратите концентрацию образца, как только объем в резервуаре достигнет минимально возможного количества, необходимого для поддержания потока в линию забора без введения пузырьков воздуха.
Закройте линию оттока зажимом. Снимите противодавление на ретентативную линию. Рециркулируйте концентрированный супернатант через фильтр в течение 10 минут, уменьшая скорость рециркуляции с 20 до 40 миллилитров в минуту для максимального восстановления.
Переместите ретентатную линию в чистый сосуд, извлеките всасывающую линию из образца и соберите концентрированный материал. Извлеките любой оставшийся материал в резервуаре для образцов с помощью пипетки. Отфильтруйте концентрированный супернатант через шприцевой фильтр длиной 0,2 мкм.
При необходимости храните конечный концентрат при четырех градусах Цельсия в течение примерно трех недель, прежде чем перейти к очистке пузырьков. Чтобы гранулировать образец концентрированной культуры, поместите его в чистую ультрацентрифужную трубку и добавьте чистую среду или буфер, чтобы убедиться, что трубка заполнена. После центрифугирования удалите супернатант пипеткой.
Повторно промыть гранулированный материал свежей питательной средой или промывочным буфером, таким как 1X фосфат-буферный физиологический раствор, и повторить центрифугирование. Повторно суспендируйте конечную гранулу в свежей культуре путем бережного пипетки одним миллилитром и переложите ее в чистый сосуд. Для выполнения ультрацентрифугирования градиента плотности готовят запасы йодиксанола, как описано в рукописи.
Смешайте одну часть буфера 4X с тремя частями 60% йодиксанола, чтобы получить 45%-ный раствор йодиксанола. Разбавляют 45% йодиксанола буфером 1X для создания запасов градиентных сред 40, 35, 30, 25, 20, 15 и 10% конечных концентраций йодиксанола. Затем аккуратно наложите равное количество всех этих запасов градиента йодиксанола в ультрацентрифужную трубку, используя весь объем трубки.
После центрифугирования соберите фракции по 0,5 миллилитра каждая для приблизительно градиента 4,5 миллилитра путем тщательной пипетки или использования дробного коллектора. Определите плотность каждой фракции, в граммах на миллилитр, используя аналитические весы и калиброванную пипетку. Извлеките образец из пробирки, определите вес и верните образец в пробирку.
Разбавьте отдельные фракции чистым буфером в новой трубке с последующей чистой средой или буферной промывкой. Осторожно нанесите пять микролитров пузырька и оставьте на пять минут. Извлеките образец, прикоснувшись краем сетки к куску чистой фильтровальной бумаги.
Пипетка выводит от 20 до 50 микролитров 2% уранилацетата на плоскую поверхность, покрытую полиэтиленовой пленкой. Затем поместите сетку, плавающую поверх нее, в течение двух минут. Удалите уранилацетат с помощью фильтровальной бумаги и ненадолго поплывите на капле сверхчистой воды для мытья.
Наполните камеру сверхчистой водой с помощью чистого шприца и убедитесь, что пузырьки воздуха не образуются. Нажмите на «Запустить камеру» и визуализируйте оптимальную область камеры вокруг отпечатка пальца. Сдвиньте ползунки усиления экрана и уровня камеры к максимуму, а затем опустите до самого низкого уровня, чтобы увидеть самые тусклые частицы.
Отрегулируйте фокус по мере необходимости, чтобы частицы были примерно одинаково видны в поле зрения, и продолжайте промывать ультрачистой водой до тех пор, пока камера не станет чистой. Добавьте образец пузырьков в камеру с помощью одного миллилитра шприца и подтвердите настройки сбора. Выберите стандартное измерение в раскрывающемся списке СОП и измените настройки, чтобы собрать по крайней мере три технические реплики видео по 60 секунд каждая.
Нажмите create'and run script', следуйте подсказкам и поместите приблизительно 100 микролитров образца в камеру между репликами. Определите параметры частиц, щелкнув по анализу 'и открыть эксперимент' и загрузив файл образца. Выберите обработать выбранные файлы' и дождитесь завершения анализа.
Выделение и характеристика внеклеточных везикул из цианобактерии Synechocystis sp. PCC6803 показали, что внешняя мембрана содержит каротиноиды, которые придают характерную оранжевую окраску образцам везикул, собранным путем прямого гранулирования посредством ультрацентрифугирования. Повторно суспендированную пузырчатую гранулу исследовали с помощью просвечивающей электронной микроскопии либо путем отрицательного окрашивания образцов уранилацетатом, либо путем наблюдения за ультратонкими срезами.
Распределение и концентрация везикул по размерам оценивались с использованием динамического рассеяния света и анализа отслеживания наночастиц. Очищенные везикулы Synechocystis sp. PCC6803 разделяли на додецилсульфатно-полиакриламидном геле и окрашивали для липополисахаридов.
Образцы должны быть взяты до и после концентрированного образца пузырьков, чтобы убедиться, что тангенциальная фильтрация потока работает и везикулы концентрируются. Затем вам нужно измерить оба образца с помощью анализа отслеживания наночастиц. В будущем потребуются усилия по объединению этого метода с другими подходами, такими, как хроматография с исключением размеров или асимметричное фракционирование полевых потоков для улучшения дискриминации и выделения мелких частиц из образцов культуры и окружающей среды.
Этот метод полезен для изучения везикул цианобактерий и конкретных функциональных ролей этих везикул в биологии цианобактерий.
