Здравствуйте, меня зовут Кай Цзинь из Университета Янчжоу. От имени нашей исследовательской группы я собираюсь представить мощный инструмент куриного эмбриона в исследованиях развития. Куриный эмбрион является классической моделью развития, которая была использована для исследования развития и дифференциации, фактически, посторонние меры лаборатории в куриные эмбрионы являются ценным инструментом для биологии развития, таким как трансфекция генов, трансгенная селекция и трансмуральный препарат гонад.
В нашей лаборатории мы установили методы инъекций мю-типа, но для многих исследователей детали инъекции неясны и трудно поддаются определению. Итак, в этом видео мы покажем подробности сосудистой инъекции на ранней стадии развития куриного эмбриона в ово. Не стесняйтесь обращаться к нам, если вы заинтересованы в этом.
Здесь мы показываем детали протокола. Сбор и подготовка оплодотворенных яйцеклеток. Во-первых, в отличие от млекопитающих, курица имеет миллионы фолликулов в одном яичнике, но только некоторые из этих фолликулов достаточно зрелые, чтобы овулировать.
Каждый фолликул содержит одну яйцеклетку или зародышевую клетку. Как только фолликул созревает и высвобождает свой желток, он включается в воронку маточной трубы. Когда фолликул входит в яремное брюшко яйцевода, сперма связывается с яйцом в организме курицы, а кальций в теле курицы образует скорлупу, которая окружает оплодотворенную яйцеклетку, образуя яйцо с мягкой скорлупой в организме.
Кальциевая скорлупа постепенно утолщается до тех пор, пока не получится яйцо. Соберите оплодотворенную яйцеклетку, академически называемую эмбриональными яйцами, и аккуратно поместите их на стойку в инкубаторе при температуре 37,8 градусов Цельсия и влажности 60%. Эмбрионы инкубируются в подходящих условиях.
После двухдневных насиживаний появляются небольшие пульсирующие красные точки, называемые первичными сердцами. Этот процесс называется вишневым взбиванием. Примерно через 2,5 дня кровеносные сосуды видны, а сердце и сегменты тела сформировались.
Игольчатый и плазмидный препарат. В качестве игл мы используем стеклянные капилляры. Перед инъекцией готовят стеклянные капилляры с наружным диаметром один миллиметр и внутренним диаметром 0,6 миллиметра.
Экзогенными материалами обычно являются плазмиды, упакованные лентивирусы и первичные половые клетки, или PGC. В этом видео мы используем синий трипан, чтобы показать следы введенных материалов. Оконной. Прежде чем подвергать эмбрионы воздействию, нам нужно стерилизовать эмбрионы, чтобы предотвратить заражение микробами.
Это делается путем аккуратного протирания поверхности эмбрионов 75% спиртовым валопчатым тампоном в месте открытия яйца. После дезинфекции аккуратно постучите щипцами по тупому концу яичной скорлупы и аккуратно обрежьте щипцами отверстие размером 0,5 сантиметра на поверхности яичной скорлупы, чтобы обнажить эмбрион. Ин-ово внутрисосудистая инъекция.
Посмотрите на вид под микроскопом, отрегулируйте фокус микроскопа, чтобы сначала найти эмбрион, а затем найти кровеносные сосуды куриного эмбриона, готовые к инъекции. Направьте иглу с экзогенным веществом на кровеносный сосуд, отмечая, что игла параллельна вводимому кровеносному сосуду. Осторожно вставьте иглу в кровеносный сосуд, а затем включите воздушный насос.
В этот момент чужеродное вещество попадает в артерию и с биением сердца циркулирует обратно к эмбриону через артерию, а затем в вену. Существует два типа сосудистых инъекций. Одна из них представляет собой инъекцию в голову, где чужеродное вещество вводится из вены в головке эмбриона и течет обратно в сердце.
Другая — дорсальная инъекция аорты, при которой чужеродное вещество циркулирует к эмбриону с биением сердца. При биении эмбрионального сердца и циркуляции крови мы можем ясно видеть, что чужеродный материал поступает капиллярами на конце артерии, в вену, а затем возвращается эмбриону из вены, что указывает на то, что введенный чужеродный материал эффективно доставляется в каждую часть эмбриона. После инъекции извлеките яйцеклетку из стереомикроскопа, вырежьте маленькими ножницами кусок медицинской ленты длиной три сантиметра и прикрепите ленту к отверстию.
Аккуратно соскоблите ленту ножницами, чтобы выдавить пузырьки воздуха, а затем вырежьте еще один кусок ленты, чтобы запечатать отверстие в крест. После запечатывания отверстия введенные эмбрионы аккуратно помещают обратно в инкубатор. Здесь мы показываем репрезентативные изображения куриных эмбрионов после инъекции.
На первом изображении показан результат инъекции плазмиды лентивируса. Зеленая флуоресценция под стереоскопическим флуоресцентным микроскопом указывает на успешную экспрессию введенной плазмиды у эмбрионов. Это говорит о целесообразности внутрисосудистой инъекции плазмид в куриные эмбрионы.
На втором снимке показаны результаты инъекции ПГК. PGC были помечены RFP. На этом рисунке мы могли видеть введенные PGC, которые являются красными точками здесь, расположенными в гонаде получателей.
Это указывает на то, что донорские PGC смогли эффективно входить и колонизироваться в гонаде реципиентов. В заключении дан протокол представлен процесс ин-ово внутрисосудистой инъекции экзогенных материалов, плазмид или ПГК в куриные эмбрионы. Метод, показанный здесь, прост в использовании и изучении и заслуживает применения во многих областях.
Это все, чем я хотел бы поделиться с вами. Я надеюсь, что такой подход облегчит вашу работу в качестве мощного исследовательского инструмента в области создания куриных эмбрионов и биологии развития. Спасибо за просмотр этого видео и удачи в ваших исследованиях.
