Хотя бесчисленные микробы колонизируют корни растений, эти взаимодействия трудно анализировать, поскольку они происходят под землей. Чтобы облегчить это, этот сборник протоколов предоставляет обзор стратегий прививки корней растений почвенными микробами. Корневая инокуляция является основой для изучения взаимодействий корневых микробов, и с помощью следующих методов взаимодействия могут быть изучены на молекулярном, цитологическом или гистологическом уровне.
Мы объясняем три системы инокуляции, используя verticillium в качестве микроба, вторгающегося в корень, и модельное растение, arabidopsis. Однако возможен перенос методов на другие растения, такие как томатный или масличный рапс, и на другие корневые микробы, например полезный серендипитат. Подготовьте verticillium inoculum заранее, культивируя мицелий в PDB и индуцируя споруляцию и бульон декстрозы Чапека.
Затем начните с наливания автоклавной среды в чашки Петри. После затвердевания среды переупакуйте чашки Петри в стерильный полиэтиленовый пакет и храните их вверх ногами на ночь в холодильнике при температуре от четырех до 10 градусов цельсия. Срежьте и удалите инфекционный канал в верхней трети затвердевшей среды скальпелем.
Избегайте попадания жидкости или воздуха под агаровую среду во время резки. Затем используйте стерильный наконечник пипетки, чтобы распределить от 50 до 100 поверхностных стерилизованных семян арабидопсиса на срезанной верхней поверхности. Поместите семена в угол, где поверхность срезанного агара соприкасается со стенкой чашки Петри, чтобы между ними могли расти корни.
Закройте чашки Петри и запечатайте их дышащей клейкой лентой, чтобы обеспечить газообмен. Держите чашки Петри в темноте при четырех градусах Цельсия в течение двух дней для расслоения, чтобы обеспечить синхронизированное и эффективное прорастание. Затем поместите пластины вертикально в стойку и выращивайте растения в камере роста в условиях долгого дня.
Через девять-11 дней, когда корни достигнут инфекционного канала, уложите пластины горизонтально и откройте их. Затем добавьте 500 микролитров свежесобранного Verticillium conidia непосредственно в инфекционный канал. Подготовьте контрольные пластины, добавив 500 микролитров макета раствора вместо спор.
Инкубируйте как контрольные, так и споровые инокулированные пластины горизонтально до тех пор, пока жидкость не впитается. Затем закройте крышку и запечатайте пластины дышащей скотчем. Накройте части корней черными бумажными ящиками, чтобы затемнить корни и почвенный грибок.
Высиживайте пластины вертикально в камере роста. Выполняйте анализы в предпочтительные моменты времени после прививки. Во-первых, стерилизуйте прозрачные пластиковые стаканчики по 500 миллилитров в 70-75% этаноловую ванну в течение 20 минут.
Высушите чашки в вытяжке с потоком ламины. Вылейте автоклавную среду в пластиковые стаканчики. Подготовьте пластиковый слой с пятью сборными отверстиями, одно большое в центре и четыре меньших в каждом углу.
Поместите пластиковый слой на среду, прежде чем она затвердеет. Вырежьте агар скальпелем через предварительно изготовленное центральное отверстие на глубину около 1,5 сантиметра. Удалите разрезанный агар, чтобы создать канал инфекции, чтобы добавить грибковые споры позже.
Слегка поцарапайте агаровую среду кончиком пипетки в четырех меньших отверстиях, чтобы прервать затвердевшую кожу. Поместите семена с помощью наконечника пипетки в меньшие отверстия. Закройте пластиковый стаканчик вторым перевернутым пластиковым стаканчиком и запечатайте дышащей скотчем.
Держите растения при четырех градусах Цельсия в течение трех дней в темноте для расслоения. Затем инкубируют чашечные системы в камере роста. Для прививки растений вертициллием добавляют в инфекционный канал один миллилитр раствора конидий.
Для контрольной группы добавьте один миллилитр свободной от микробов одну четвертую МС-среду в качестве имитационного раствора. Выполняйте анализы в предпочтительные моменты времени после прививки. Сначала тщательно смешайте почву и песок в объемном соотношении три к одному, что облегчит промывание субстрата от корней в дальнейшем.
Перелейте смесь в автоклавный мешок и пропарьте при 80 градусах Цельсия в течение 20 минут в автоклаве. Наполните горшки почвенно-песчаной смесью и переложите их в лотки. Добавьте воду в лотки примерно на одну треть высоты горшка для равномерного замачивания почвенно-песчаной смеси.
Разбрызгивайте смесь водой для обеспечения влажных условий запуска. Посейте три-четыре семени в каждом горшке на достаточном расстоянии друг от друга. Держите их для расслоения при четырех градусах Цельсия в течение трех дней в темноте.
Дайте саженцам расти в условиях долгого дня при регулярном поливе, затем соберите растения аналогичного размера и возраста для выполнения корневой прививки. Выньте почву из горшков и выкопайте корни. Аккуратно вымойте корни в емкости для воды и держите розетки подальше от воды.
Инкубируйте корни в течение 60 минут в чашке Петри, содержащей раствор спор вертициллиума или макетный раствор. Подготовьте новые горшки с влажной паровой стерилизованной почвой без песка. Используйте наконечник пипетки, чтобы сделать отверстие в центре почвы в каждом горшке.
Поместите корни непосредственно в отверстие и аккуратно заполните отверстия почвой, чтобы избежать дополнительного стресса для растений. Культивируйте растения в длительных дневных условиях с регулярным поливом. Выполняйте анализы в предпочтительные моменты времени после прививки.
В системе на основе чашки Петри успешная инфекция verticillium была визуализирована в корнях арабидопсиса. Через два дня после инокуляции маркерный ген MYB51 был сильно индуцирован в инфицированных корнях по сравнению с контролем, что было подтверждено анализом QRTPCR. В системе на основе чашек было обнаружено большое количество грибковой ДНК в листьях зараженных растений, как показывает график, по сравнению с имитацией контроля после 12 дней прививки.
Анализ QRTPCR показал обогащенное содержание транскрипта маркерного гена MYB51 в корнях арабидопсиса. Используя эту систему, вертициллий был привит другим модельным видам растений. У масличного рапса грибковая ДНК была обнаружена в стеблевых сегментах, срезанных у основания рассады через 12 дней после прививки у корней.
Грибковая ДНК также была обнаружена в стеблях томатов, что указывает на размножение патогена внутри растения. Через 21 день после посева с использованием почвенной системы розетки обработанных растениями арабидопсиса выглядели здоровыми и зелеными, в то время как зараженные растения имели желтоватые или некротические листья и имели меньшую площадь зеленых листьев по сравнению с имитацией, указывающей на успешную инфекцию. Обратите внимание при перерезании инфекционного канала в системе чашки Петри, чтобы предотвратить скольжение агара.
Применяя почвенную систему, не сжимайте почву вокруг корней во время пересадки, чтобы избежать дальнейшего стресса для растений. После корневой прививки, например, могут быть выполнены патогенные тесты, анализ экспрессии генов, функциональная геномика или агрохимические тесты, обеспечивающие новое понимание взаимодействий корневых микробов и инструментов для улучшения сельского хозяйства.
