Этот протокол предусматривает способ получения нескольких сотен многоклеточных опухолевых сфероидов в каждой лунке многолуночной пластины, подходящей для автоматизированной микроскопии. Полученный сфероид может быть классифицирован в различные классы размеров, а субклетовая информация может быть извлечена из каждой клетки. Метод производит достаточное количество сывороток, которые могут быть использованы в прямом скрининге и исследованиях РНК-интерференции.
Разбавить материал фундамента ECM в холодной фенольной красной свободной среде сыворотки с помощью предварительно охлажденных наконечников, выдержанных при температуре минус 20 градусов Цельсия. Я ставлю 15 микролитров материала фундамента ECM и среднего раствора в пластину визуализации 96 скважин. Центрифугируйте пластину в течение 20 минут при 91 G при четырех градусах Цельсия.
Инкубировать пластину не дольше 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Добавьте трипы и ЭДТА в ячейки. Инкубируя клетки при 37 градусах Цельсия в конце инкубации, мы подвешиваем клетки в полной среде, содержащей 10% FBS.
Пипетка 10 микролитров клеточной суспензии, в счетную камеру гемоцитометра. Подсчитайте количество ячеек в четырех квадрантах камеры. Centra просматривает клетки в 135 раз G в течение четырех минут при комнатной температуре.
Одна из этих клеток гранулируется, аспирирует супернатант и повторно суспендирует клетки в фенольной красной свободной полной среде для получения концентрации от 10 до шести клеток на миллилитр. Развести клетки в фенольной красной свободной полной среде. Посмотрите на клетки по каплям в круговом движении в общем объеме 35 микролитров на лунку.
Инкубируйте клетки в течение одного часа при 37 градусах Цельсия в увлажненном инкубаторе с 5% углекислым газом. При 1,2 микролитрах материала фундамента ECM до 23,8 микролитров феноловой красной свободной полной среды на скважину, в результате чего получается конечный объем 60 микролитров на скважину. Инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия в увлажненном инкубаторе с 5% углекислым газом.
На следующий день замените среду 100 микролитрами свежей фенольной красной свободной полной среды. Вставьте 96-луночную пластину, содержащую сфероиды, в конфокальный скрининговый микроскоп с высоким содержанием. Выберите подходящие лазеры, чтобы возбудить используемые полы.
Получайте каналы последовательно, чтобы избежать перекрестных помех, изображайте сфероиды с помощью соответствующих целей. Чтобы проанализировать морфологию сфероидов, сегментируйте сфероиды на основе флуоресцентно сопряженного FLoid и окрашивания. Сегментация ядер основана на шестигранном трех-, трех-, трех-, четырех-, двух окрашивании.
Сегментация цитоплазмы каждой клетки остаточным шестнадцатеричным тремя, тремя, четырьмя, двумя пятнами, которые присутствуют в цитоплазме клетки. Рассчитайте различные морфологические свойства сфероидов, включая объем, площадь поверхности, сферичность и количество ядер на его сфероиды. У Росса есть изображения для удаления сфероидов размером менее 75 кубических микрометров и более 900 000 кубических микрометров.
Чтобы проанализировать одну клетку внутри сфероидов, сегментируйте сфероиды на основе флуоресцентно сопряженного сфероидного окрашивания. Сегментация ядер основана на шестигранном трех-, трех-, трех-, четырех-, двух окрашивании. Сегментация цитоплазмы каждой клетки остаточным гексом три, три, три, четыре, два пятна, которое присутствует в цитоплазме клетки.
Сегментация лизосом на основе вторичного окрашивания антителом. Рассчитайте различные морфологические свойства клеток внутри каждого сфероида, включая количество лизосом на клетку, объем клетки и площадь поверхности клетки. На рисунке хорошо показаны обзоры трех различных типов сфероидов, включая изображения на разных конфокальных плоскостях.
Также показан объемный вид целых сфероидов. На рисунке показан процесс сегментации рН, на панели А показаны все сфероиды в объемном виде. Панель B отображает множественную сегментацию цитоплазмы, ядер и лизосом во всех клетках одного сфероида.
Цитоплазма и ядра сегментированы на основе шестигранного трех, трех, трех, четырех, двух окрашивания. А лизосомы сегментируются на основе окрашивания антилабораторного одного антитела. Панели C отображаются так же сегментированно, как и панель B, но в трех видах.
Могут быть проведены различные морфологические измерения на уровне сфероидов. Эти измерения включают в себя расчет количества ядер на сфероиды, а также их felicity, объема и площади поверхности pH. Типичный объем каждой клетки в трех сфероидных типах.
А также количество лизосом на клетку показаны на этом рисунке. Оптимизация начальной плотности сидения ячеек в начале генерации SP является критическим шагом. На рисунке показано, что добавление слишком большого количества клеток все еще позволяет образованию сфероидов.
Однако это может привести к слиянию сфероидов. Полученные таким образом сфероиды могут быть подвергнуты транскриптомному и протеомному анализу. Этот метод используется для количественного анализа поглощения лекарственного средства доставкой таких наночастиц и оценки их токсичности для отдельных клеток в сфероидах.
