Мы разработали новый метод с использованием XF-анализатора морского конька для непосредственного измерения скорости потребления кислорода. Но общий прокси для митохондриальной функции в остром скользящем срезе у взрослых мышей. Этот метод измеряет клетку энергетикой в проколах от анатомически определенных структур мозга.
Использование острых срезов более близко имитирует физиологическую клеточную среду, которая не может быть достигнута способами выделения митохондриальных или культуральных клеток. Этот метод будет представлять широкий интерес для исследователей, работающих в области болезни Паркинсона и болезни Гентингтона. Для начала откройте комплект для анализа внеклеточного флюса и извлеките картридж датчика и пластину полезности.
Затем отложите картридж датчика в сторону и не прикасайтесь к датчикам. Затем добавьте 600 микролитров калибровочного раствора на каждую стенку полезной пластины. Поместите картридж датчика поверх вспомогательной пластины и погрузите датчики в калибровочный раствор, убедившись, что треугольная выемка наконечника утилиты и картриджной пластины датчика правильно выровнены.
После этого запечатайте внеклеточный набор для анализа флюса герметизирующей пленкой, чтобы предотвратить испарение калибровочного раствора, а затем поместите его в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия, не дополненный углекислым газом или кислородом, на ночь. Откройте микропластинку захвата люверса и выньте пластинку люверса для сидения ткани. Затем нагрейте соответствующий объем предварительно насыщенного кислородом модифицированного буфера спинномозговой жидкости до 37 градусов Цельсия в 50-миллилитровой трубке.
Затем добавьте BSA к конечной концентрации в четыре миллиграмма на миллилитр, чтобы подготовить буфер дыхания. Осторожно добавьте 625 микролитров буфера дыхания в каждую лунку проушной пластины, избегая встряхивания пластины, гарантируя, что в буфере каждой лунки не будет пузырьков воздуха. Немедленно рассекните мозг на 10 миллилитрах ледяного предварительно насыщенного кислородом режущего раствора.
Затем, используя вибратомную секцию корональных стриатальных срезов, следуя инструкции производителя толщиной 150 мкм в ледяном предварительно оксигенированном режущем растворе. Далее восстанавливают срезы в 50 миллилитрах насыщенной кислородом искусственной спинномозговой жидкости. И выдерживают их в растворе до 30 минут при комнатной температуре.
После восстановления переложите ломтики на чашку Петри размером 35 на 10 миллиметров с пятимиллиметровым буфером дыхания. Используя биопсийный перфоратор из нержавеющей стали, создайте круглый кусок ткани в нужной области разрезанного мозга, осторожно надавливая на перфоратор, сохраняя срез в буфере. Затем удалите остальную часть ткани, поднимите перфоратор и удалите круглый кусок ткани в буфер.
Затем вырежьте самый конец наконечника пипетки в один миллилитр, чтобы сделать отверстие диаметром от одной точки пять до двух точек-ноль миллиметров, и используйте его для удержания и переноса перфорированного среза в верхнюю часть экрана захвата. Всасывайте один кусок перфорированной мозговой ткани и осторожно поместите ткань на сетчатую сторону экрана захвата, круглый кусок пластика с сеткой, прикрепленной к одной стороне. С помощью бумажной салфетки аккуратно высушите экран захвата и удалите влагу, которая позволяет ткани стать липкой и прикрепленной к центру сетки.
Затем удерживайте пинцетом экран захвата разрезом вниз и поместите его в один из колодцев инкубирующей пластинки люверса. Затем инкубируют пластинку люверса при 37 градусах Цельсия в инкубаторе в течение не менее 30 минут, чтобы обеспечить уравновешивание температуры и рН перед запуском анализа. Разбавляют нужные соединения и модифицируют искусственную спинномозговую жидкость без BSA до конечной концентрации запаса рабочей концентрации для портов от А до D соответственно.
Осторожно предварительно загрузите 75 микролитров разбавленных соединений в соответствующие отверстия для впрыска картриджа датчика, поместив наконечники наполовину в порты впрыска под углом 45 градусов наконечником к стенке инжекционного порта, так как полная вставка может привести к утечке соединения через порт. После этого осторожно извлеките наконечники из портов, не создавая пузырьков воздуха, и не касайтесь какой-либо части картриджа, чтобы избежать образования пузырьков воздуха. Затем визуально осмотрите инжекторные отверстия для равномерной загрузки, убедившись, что вся жидкость находится в порту и на верхней части картриджа нет остаточных капель.
После размещения картриджа датчика на вспомогательной пластине поместите его в инкубатор на 30 минут, чтобы он нагрелся до 37 градусов по Цельсию при осторожном обращении, только держась за опорную пластину и двигаясь как можно меньше. Сначала загрузите шаблон анализа в программное обеспечение, а затем нажмите зеленую кнопку запуска. Затем загрузите картридж датчика на вспомогательной пластине в лоток прибора, убедившись, что пластина сидит правильно и плоская, загружая заполненный лекарством картридж датчика в анализатор для калибровки.
После этого следуйте инструкциям на экране, чтобы выполнить калибровку. И уравновешивайте датчики. Как только этап уравновешивания будет завершен, снимите калибровочную пластину и замените ее пластинкой люверса, содержащей сетку и срезы ткани.
Затем измерьте скорость потребления кислорода в каждой лунке пластины, используя протоколы анализа, как описано в рукописи. Затем проанализируйте данные измерения скорости потребления кислорода и данные об эффективности связи. Нормы потребления кислорода для различных толщин и размеров перфораторов срезов в контрольной группе показали стабильное базальное дыхание в течение всего измерения и были пропорциональны объему среза.
Кроме того, показатели потребления кислорода были относительно стабильными в течение пяти часов с менее чем 10%-ным сокращением. Сравнивалась эффективность митохондриальной связи, и срез толщиной 150 микрометров и размером перфоратора 1,5 миллиметра показал самую высокую эффективность связи. Показатели потребления кислорода были измерены для молодых и старых групп нокаута Pink1 и их возрастных мышей дикого типа.
Уровень базального потребления кислорода был аналогичен как в нокаутных, так и в диких группах для молодых мышей. Однако он уменьшился для нокаутирующих мышей в старой группе. Тем не менее, митохондриальная дисфункция у нокаутных мышей наблюдалась для молодой возрастной группы, о чем свидетельствует снижение эффективности связи, вызванное нокаутом Pink1.
Критические шаги в этом протоколе включают в себя подготовку срезов мозга, перенос их в верхнюю часть экрана захвата, размещение слайдов в колодцах и прикрепление их к экрану захвата во время измерений.
