Характеристика экспрессии генов на транскриптомном уровне является ключом к пониманию функции клеток в здоровье и болезни. Наш метод фокусируется на захвате эндотелиальных клеток, решающего слоя сосудистой стенки, из менестерических артерий доноров человека для транскриптомного профилирования с одноклеточным и пространственным разрешением. Существует обогащенная популяция эндотелиальных клеток из сосуда без этапа сортировки, что может вызвать потерю клеток.
Кроме того, существуют другие типы клеток, которые позволяют исследовать взаимодействия клеток и клеток в тканевом контексте. Мы использовали эту технику для исследования артериальных изменений при диабете и ожирении. В зависимости от наличия сосуда, эти методы также могут быть перепрофилированы для изучения биологии при других сосудистых и других заболеваниях.
Если это первый раз, два ключевых шага требуют наибольшей практики. Во-первых, соскоб, хотя и достаточная сила, должна быть приложена для удаления интегральных клеток без отрыва более глубоких слоев. И второе, криостатное секционирование.
Убедитесь, что секции холодные, плоские и находятся в пределах специализированной горки. Продемонстрировать процедуру будут Инцзюнь Ло и Сяофан Тан, два постдокторских исследователя из моей лаборатории. Для начала промыть салфетки с ДПБС.
Стерильными щипцами и рассеченными ножницами удалите жир и наружные соединительные ткани до тех пор, пока сосуд не очистится. Измерьте длину сосуда с помощью линейки, размещенной вне тарелки, и сделайте фотографические записи. Перережьте брыжеечную артерию ножницами, чтобы открыть просвет сосуда вертикально.
С помощью игл прикрепите сосуд к черному воску на всех четырех углах, обнажив интиму. Добавьте в интиму один миллилитр предварительно разогретого буфера пищеварения. С помощью стерильного скальпеля дважды аккуратно соскоблите просвет сосуда.
Перенесите буфер пищеварения в трубку. Добавьте один миллилитр буфера пищеварения в интиму и пипетку вверх и вниз осторожно, чтобы собрать оставшиеся клетки и перенести клеточную суспензию в трубку. Инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут в инкубаторе или на коромысле.
Добавьте среду M199 в клеточную суспензию, чтобы погасить ферментативную реакцию, и аккуратно перемешайте. Центрифугируйте суспензию в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и 600 раз G.At конце центрифугирования, удалите и храните супернатант отдельно в качестве контрольной культуры, чтобы наблюдать, все ли клетки захвачены в грануле. Затем повторно суспендируйте ячейку гранулы в одном миллилитре среды M199.
Оцените жизнеспособность клеток, смешав 10 микролитров трипан-синего с 10 микролитрами клеточного материала. Наблюдайте за морфологией клеток и подсчитывайте клетки с помощью гемоцитометра. Нанесите покрытие на две скважины шестилуночной плиты путем пипетки 500 микролитров реагента крепления в скважины в течение 30 минут при комнатной температуре.
После промывки колодцев стерильным DPBS дозируйте полный клеточный запас в одну лунку, и супернатант хранится в качестве контроля во второй лунке. Центрифуга предварительно подготовленного клеточного запаса при четырех градусах Цельсия и 600 раз G в течение пяти минут. Удалите супернатант и осторожно суспендируйте гранулу с помощью пипетки P-1000 в 0,04% BSA в DPBS.
Хорошо перемешайте, чтобы получить одноклеточную суспензию. Пропустите раствор через 40-микрометровый сетчатый фильтр для удаления остатков клеток. Затем центрифугируйте суспензию и удалите супернатант, как показано на рисунке.
Повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах 0,04% BSA в DPBS с использованием пипетки P-1000 и хорошо перемешайте для обеспечения одноэлементной суспензии. Как было показано ранее, оцените жизнеспособность клеток с помощью трипан-синего цвета. Используя гемоцитометр или автоматизированный счетчик клеток, наблюдайте морфологию одноклеточной суспензии, проверяйте наличие тканевого мусора и вычисляйте количество живых и мертвых клеток.
После добавления изопентана в металлическую канистру охладите жидким азотом или сухим льдом. Разливайте ОКТ-компаунд в лунки из маркированной пластиковой криоформы, предотвращая образование пузырьков. Оставьте криоформу на сухом льду, чтобы остыть.
Вырежьте не менее двух корональных сечений длиной в один сантиметр по длине сосуда. Используя 12-дюймовые щипцы, погрузите ткань в изопентан до замораживания. Быстро погружайте ткань в ОКТ в ориентации с просветом, видимым в центре.
Возьмите и поместите криоформы на сухой лед и наблюдайте за замерзанием. OCT постепенно станет белым снаружи в течение одной-двух минут. Храните эти секции в защищенном контейнере при минус 80 градусах Цельсия до полугода.
Установите желаемую температуру криостата для камеры и головки образца. Уравновешивайте секции сосудов, ножи, щетки и слайды до минус 20 градусов по Цельсию в криостате в течение примерно 30 минут. Во время уравновешивания очистите машину и все оборудование, которое может касаться секций, включая лезвие, 70% этанолом с последующим раствором для обеззараживания РНКазы.
Прикрепите образец, дозируя небольшое количество ОКТ на круговой блок криостата и помещая образец сверху, прежде чем он замерзнет. Поместив блок в центр головки образца, прикрутите блок на место, используя высокую черную ручку слева. Отрежьте все лишние ОКТ, окружающие сосуд.
Установив толщину резания до 10 микрометров на криостате, вырежьте примерно 60 секций и поместите их в предварительно охлаждаемую 1,5-миллилитровую трубку, содержащую реагент для экстракции РНК. Вихрь до тех пор, пока секции полностью не растворятся. Извлеките РНК, как описано в рукописи текста, и растворите очищенную гранулу РНК в пяти микролитрах воды, свободной от РНКазы.
Вырежьте участки толщиной 10 микрометров с поперечной пластиной на месте. Переверните и аккуратно расплющите, осторожно коснувшись секции через окружающий OCT. Протрите горку этанолом и предварительно разогрейте заднюю часть области захвата пальцем.
С помощью криостатных кистей без РНК или непосредственного слайда поместите участок ткани в квадрат, используя только окружающий OCT. Немедленно поместите один палец на заднюю сторону области захвата, чтобы расплавить участок на слайде. Как только секция прилипнет, поместите слайд на криобар, чтобы секция замерзла.
Вырежьте участки тканей толщиной 10 микрометров, как было продемонстрировано ранее, на слайдах оптимизации тканей или экспрессии генов. Перенесите слайд в скользящую почтовую машину, размещенную на сухом льду. На рисунке изображены изолированные EC, культивируемые с использованием описанного протокола, отображающие отчетливую булыжниковую морфологию с минимальными загрязняющими клетками.
Экспрессия ЭК маркера сосудистого эндотелиального кадгерина была подтверждена с помощью иммунофлуоресценции, визуализирующей межклеточные соединения. Примерно 80% клеток были CD31-положительными, что указывает на то, что брыжеечные артериальные ЭК человека составляли большую часть недавно изолированной клеточной популяции. Неудачные выделения приводят к клеткам с нарушенной морфологией, потенциально экспрессирующим мезенхимальным маркерам или удлиняющимся, напоминающим фибробластное состояние.
На рисунке показана репрезентативная однородная многообразная аппроксимация и проекция, выделенная для брыжеечной артерии с использованием настоящего протокола для секвенирования одноклеточной РНК на изолированной брыжеечной артериальной ECS человека, причем 34% клеток сгруппированы в виде ЭК, использующих PECAM1 и VWF в качестве маркеров. РНК высокого качества должна показывать число целостности РНК не менее шести, а соотношение 28S к 18S рибосомным полосам РНК максимально приближено к двум. Слабые или отсутствующие эти рибосомные сигналы РНК могут наблюдаться при деградации РНК.
Окрашивание гематоксилином и эозином визуализировало морфологию сосуда, что позволило идентифицировать интересующие области. Экспрессия генов была визуализирована с пространственным закреплением на сосуде, окрашенном гематоксилином и эозином. Осторожно обрабатывайте ткани и клеточный запас для поддержания качества РНК, особенно для пространственного профилирования транскриптома.
Убедитесь, что ткань помещена на сухой лед, чтобы уменьшить деградацию РНК. Кроме того, обрабатывайте срезы и ткани предварительно охлаждаемыми инструментами. Мы смогли изучить изменения экспрессии генов EC, включая LncRNAs в контексте диабета и их взаимодействия с другими типами клеток.
Мы можем вывести местоположение этих транскриптомных изменений, используя методы пространственного профилирования транскриптома.
