В кровеносном сосуде количество эндотелиальных клеток очень низкое, что затрудняет их изучение. Наш протокол устраняет это ограничение и позволяет нам изучать новые молекулярные пути и терапевтические средства. Наш протокол позволяет нам получить образцы, обогащенные эндотелием, и изучить, как острый и хронический нарушенный поток влияет на этот тип клеток.
Возможность более детального изучения эндотелиальных клеток позволяет определить гены-мишени и, следовательно, потенциальные терапевтические средства для атеросклероза, нацеленные на эндотелиальные клетки. Изоляция сонной артерии сложна и требует терпения и опыта. Для начала подготовьте животное, введя 0,05 миллиграмма на килограмм бупренорфина подкожно.
Стерилизуют эпилированную область с помощью бетадина и раствора изопропанола три раза. Сделайте вентральный разрез средней линии примерно на один сантиметр в области шеи. Затем обнажите точку ветвления LCA тупым рассечением.
Обжигайте левую внутреннюю сонную, наружную сонную и затылочную артерии 6-0 швами, оставляя верхнюю артерию щитовидной железы нетронутой. Закройте разрез тканевым клеем или швами. Переведите мышь в предварительно нагретую восстановительную клетку, выдерживаемую при температуре 37 градусов цельсия.
Поместите мышь на чистое полотенце на срок до одного часа, чтобы избежать переохлаждения после операции. Вставьте иглу 21 калибра в линию IV, подключенную через верхушку сердца в левый желудочек. Оставьте ретроградную перфузию в течение двух-трех минут, используя обычный физиологический раствор при комнатной температуре.
Поддерживайте постоянную скорость потока, применяя постоянное давление во время впрыска или используя внутривенную линию и сохраняя солевой мешок на высоте от восьми до девяти футов. Удалите кожу из области шеи со всеми жирами, мышцами и соединительными тканями, чтобы обнажить сонные артерии. Затем удалите периадвентициальные ткани вокруг сонных артерий, оставив сонную артерию прикрепленной к телу.
Сделайте разрез ниже места перевязки в LCA, чтобы обеспечить перфузию. Перфузируйте LCA через левый желудочек еще на минуту, чтобы удалить любые следы крови. Промывайте внешнюю часть сонных артерий обычным солевым раствором, чтобы удалить любые следы крови.
Используйте инсулиновый шприц с иглой 29 калибра для введения 50 микролитров буфера пищеварения в просвет дистального конца левой сонной артерии. Используйте микрозажим, чтобы зажать проксимальный конец сонной артерии, заполненный буфером пищеварения. Добавьте от 15 до 20 микролитров буфера пищеварения в просвет и обрежьте дистальный конец, чтобы избежать высвобождения буфера пищеварения.
Перенесите сонные артерии от мыши в 35-миллиметровые чашки, содержащие теплый буферизованный солевой раствор HEPES 37 градусов цельсия. И высиживать их в течение 45 минут при 37 градусах Цельсия с прерывистым раскачиванием. Удалите сонную артерию с помощью зажимов из 35-миллиметровой чашки после завершения просветного ферментативного пищеварения.
Аккуратно отсоедините зажимы, чтобы буфер пищеварения не протекал. Держите один конец сонной артерии поверх трубки микроцентрифуги объемом 1,5 миллилитра. Добавьте 100 микролитров теплого буфера пищеварения в просвет, вставив иглу 29 калибра, оснащенную инсулиновым шприцем.
Быстро промыть просвет сонной артерии в трубке микроцентрифуги, затем добавить 0,3 микролитра FBS в трубку, чтобы остановить реакцию. Поместите трубку микроцентрифуги на лед. Центрифугируйте ячейки при 500 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, используя центрифугу, оснащенную ротором с фиксированным углом, и выбросьте супернатант.
Повторно приостановите клетки в буфере пищеварения, содержащем реагент диссоциации клеток, и инкубируйте их в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия, чтобы разделить их на отдельные клетки. Блокируют ферментативную реакцию, добавляя 0,15 миллилитра FBS к 0,5 миллилитровой трубке, и повторяют центрифугирование. Отбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки в 100 микролитрах ледяного холодного 1%-го раствора BSA в PBS в 0,2-миллилитровой микроцентрифужной трубке.
Для анализа одной клетки повторно суспендируйте гранулу со 100 микролитрами ледяного холода 1% BSA в PBS в трубке 0,2 миллилитра. Для анализа одного ядра повторно суспендируйте клеточную гранулу в 100 микролитрах 0,04% BSA в ледяном PBS и центрифугируйте одноклеточную суспензию при 500G при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Разложить одноклеточную суспензию с буфером лизиса ледяного холода и инкубировать в течение пяти минут на льду.
Смешайте лизат с пипеткой P20 и инкубируйте еще 10 минут. После этого переложите лизат в 0,5-миллилитровую трубку. Вымойте ячейки ly 500 микролитрами буфера и перемешайте их с помощью пипетки.
Затем повторите центрифугирование. Отбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулы ядер в 150 микролитрах разбавленного буфера ядер. Подсчитывайте препараты одиночных ядер с помощью гемоцитометра.
После исследования секвенирования одиночных ядер одноклеточные и одиночные ядра были получены и визуализированы с помощью ярко-полевой и фазово-контрастной микроскопии. Также была продемонстрирована эффективность получения одиночных ядер из одноклеточной суспензии. После исследования секвенирования одноклеточной РНК были получены различные параметры, такие как распределение генов на клетку, уникальный молекулярный идентификатор на клетку, показания митохондрий на клетку и данные насыщения секвенирования.
Для исследования последовательности ATAC с одной клеткой наблюдалось распределение размеров вставки, включая паттерн полос нуклеосом. Также наблюдался нормализованный показатель обогащения СТШ. Кроме того, процентный фрагмент считывается в пиках.
Определены фрагменты пиковой области, показатель обогащения СТШ, соотношение считываний в геномных сайтах черного списка и отношение сигнала нуклеосом. Ферментативное пищеварение является стрессом для клеток, поэтому крайне важно поддерживать образцы на льду и выполнять процедуру как можно быстрее. Мы можем использовать этот метод для получения пластинчатых эндотелиальных клеток от мышей.
Мы также можем использовать эту технику для проведения массовых исследований на основе Omix. Этот метод проложил путь для изучения влияния нарушенного кровотока на эндотелиальные клетки in vivo одноклеточным способом.
