Наша комбинация лазерной микродиссекции и масс-спектрометрии позволяет исследовать пространственно разрешенные изменения на протеомном уровне в любом виде ткани. В нашем случае это гранулы нейромеланина. Наш протокол позволяет проводить протеомный анализ на основе ограниченного образца материала.
Что обычно является большой проблемой при работе с посмертной тканью мозга. Поскольку отдельные клетки могут быть выделены для сравнения здоровых и болезненных состояний на протеомном уровне. Это может улучшить наше понимание механизмов заболевания.
Для начала поместите скольжение тканевой мембраны в держатель слайда на робо-сцене с тканью, обращенной вверх. Для получения обзорного сканирования участка ткани. Воспользуйтесь функцией сканирования, выберите интересующую область в левом верхнем и правом нижнем углах.
Затем выберите Сканировать все ROI для выполнения сканирования. Для автоматического отбора гранул нейромеланина в текущем поле зрения. Выберите анализ поля зрения.
Затем выберите инвертировать результат и установите пороговое значение для каналов RGB. Таким образом, только гранулы нейромеланина подсвечиваются красным цветом в окне предварительного просмотра. Теперь нажмите ok, чтобы использовать настроенные настройки для поля зрения.
Отрегулируйте настройки лазера, используя только область слайда, покрытую мембраной. Заполните крышку пробирки для сбора проб 50 микролитрами сверхчистой воды. И вставьте колпачок в коллектор робомотора.
Используя программный интерфейс, расположите робо-движитель над вторым этапом робо, чтобы начать сбор образцов. Запустите лазер. Управляйте настройками энергии и фокусировки во время лазерного процесса и при необходимости регулируйте настройки.
Обеспечьте надлежащую изоляцию и катапультирование изолированных объектов в колпачок пробоотборника по крайней мере для первых 10 объектов. После завершения отбора проб переместите робота в исходное положение и извлеките трубку для сбора проб. После прядения образцов путем центрификации.
Высушите образцы в течение 1,5 часов в вакуумном концентраторе. После выполнения триптического пищеварения, как описано в тексте. Подготовьте образец для анализа ВЭЖХ-МС путем растворения от 200 до 400 нанограммов пептидов образца в определенном объеме 0,1% TFA.
В инертных масс-спектрометрических стеклянных флаконах входные отверстия. Если определение концентрации не применимо из-за низкого количества пробы. Проверьте одинаковую загрузку образца, сравнив общий ионный ток.
Начать анализ протеомных необработанных данных. Нажмите кнопку Загрузить для загрузки необработанных файлов в программное обеспечение. Щелкните Установить эксперимент, чтобы назначить имена образцов.
Определение параметров, специфичных для группы. Добавьте модификации, выбрав деамидацию NQ, окисление M и карбамидометилирование N-term в качестве переменных модификаций. а затем добавить карбамидометилирование С в качестве фиксированной модификации.
Выберите трипсин в качестве фермента пищеварения во вкладке пищеварения. На вкладке Бесплатное количественное определение меток добавьте опцию LFQ и, если необходимо обработать более 10 файлов, выберите опцию быстрого LFQ, чтобы сократить время обработки. Обеспечение того, чтобы все остальные параметры группы оставались в заводских настройках.
Перейдите на вкладку Глобальные параметры и добавьте файл FASTA, производный от uniprot. org на вкладке последовательностей. Измените правило идентификатора соответствующим образом.
И добавьте идентификатор таксономии 9606 для Homo sapiens. Для количественной оценки белка выбирают уникальные и бритвенные пептиды. Затем добавьте опцию iBAQ в качестве меры для количественной оценки белка на вкладке бесплатной количественной оценки метки.
Убедитесь, что все остальные глобальные параметры остаются в заводских настройках, и нажмите кнопку Пуск. После успешного проведения анализа извлеките белковые группы. вывод txt.
Загрузите белковые группы. txt файл в аналитическом программном обеспечении. Добавьте значения iBAQ в качестве основных столбцов и отсортируйте все остальные столбцы в соответствии с их типом.
Отфильтровывайте приманки и загрязняющие вещества, фильтруя строки на основе категориального столбца и фильтруя результаты на основе допустимых значений. Экспортируйте выходные данные в формате txt для дальнейшей обработки. И оцените результаты относительно исследовательского вопроса.
В настоящем исследовании 1 898 белковых групп были идентифицированы в NMG и 1 565 были идентифицированы в окружающей ткани SN, из которых 1 384 были идентифицированы в обеих областях ткани. Таким образом, 514 и 181 белковая группа были идентифицированы исключительно в NMG и SN ткани соответственно. В репрезентативных измерениях DDA.
Несколько более высокие значения iBAQ в NMG по сравнению с SN указывали на более высокое содержание белка цитоплазматического диниена-1, тяжелой цепи 1 в NMG. Это наблюдение может быть проверено в экспериментах PRM для пептида ESPEVLLTLDILK. В котором было обнаружено более высокое изобилие ВНГ.
На основе пиковой области на уровне MS1 и MS2. Наиболее важным шагом на сегодняшний день является изоляция НМГ, поскольку остальная часть протокола основана на том, что этот шаг должен быть выполнен должным образом. После процедуры LMD образцы могут быть использованы и дополнительно обработаны для любого вида омической техники, такой как геномика, транскриптомика, протеомика или липидомика.
