Этот протокол важен, потому что он может быть использован для визуализации и опроса воспалительного пути каспазы на молекулярном уровне в живых клетках в определенном болезненном состоянии. Основным преимуществом данной методики является то, что ее можно использовать для выявления компонентов, требований и локализации воспалительных комплексов активации каспазы в первичных иммунных клетках. При незначительных оптимизациях этот метод может быть адаптирован к другим первичным клеткам и ряду белков, активированных олигомеризацией, и его применимость не ограничивается микроскопическими методологиями.
Во-первых, аспирировать среду из полностью дифференцированных макрофагов на 10-сантиметровой посуде и промыть клеточный монослой теплой сывороточной свободной средой RPMI-1640, удалив всю среду полностью. Соберите клетки, добавив два миллилитра 0,25% теплого раствора трипсина-ЭДТА на 10-сантиметровую чашку. Аккуратно пипетку трипсина-ЭДТА вверх и вниз по всей посуде с помощью микропипетки P-1000, затем переложите суспензию в коническую трубку объемом 15 миллилитров, содержащую пять миллилитров теплой полной питательной среды.
Проверьте отделение клеток под ярким полевым микроскопом и при необходимости снова отсоедините. Аспирируйте среду и повторно суспендируйте клетки в 10 миллилитрах 1X стерильного PBS, предварительно нагретого до 37 градусов Цельсия. Затем возьмите 20-микролитровую аликвоту для определения номера клеток с помощью гемоцитометра.
Возьмите от одного до двух раз от 10 до пятой клетки на трансфекцию и поместите их в 15-миллилитровую трубку. Доведите до конечного объема 15 миллилитров с предварительно нагретым 1X стерильным PBS. Аспирируйте PBS и центрифугу еще раз в течение одной минуты при 250 х г.
Удалите все остатки PBS из гранулы ячейки с помощью микропипетки P-200. Возьмите 1,5 миллилитр стерильную микротрубку на трансфекцию и добавьте соответствующие репортерные плазмиды и каспазные плазмиды BiFC в капот. Поместите пипетку, устройство, наконечники, электропорационные трубки и пипетку в стерильный ламинарный вытяжной.
Подключите и включите нуклеофекционное устройство. Введите параметры transection на экране запуска. Нажмите на Напряжение, введите 1000 и нажмите Готово, чтобы установить его на 1000 вольт.
Нажмите на Width, введите 40 и нажмите done, чтобы установить импульс равным 40 миллисекундам. Наконец, нажмите на Импульсы, введите 2 и нажмите Готово, чтобы установить число электрических импульсов равным 2. Возьмите одну из электропорационных трубок и заполните ее тремя миллилитрами электролитического буфера Е при комнатной температуре.
Вставьте электропорационную трубку в держатель пипетки на пипетке, убедившись, что электрод на стороне трубки обращен внутрь и при вставке трубки слышен звук щелчка. Возьмите гранулу ячейки и добавьте 10 микролитров предварительно подогретого R-буфера повторной суспензии для каждого от одного до двух раз по 10 к пятой клетке и аккуратно перемешайте с микропипеткой P-20. Добавьте 10 микролитров клеточной суспензии в каждую трансфекционную трубку и аккуратно перемешайте с микропипеткой P-20.
Вставьте наконечник в пипетку, нажав кнопку ко второму узлу, гарантируя, что зажим полностью подхватывает крепежный шток поршня в наконечнике. Затем нажмите кнопку на пипетке до первой остановки и опустите в первую трубку, содержащую смесь клеточной или плазмидной ДНК, чтобы аспирировать образец. Вставьте пипетку с образцом очень осторожно в держатель пипетки, убедившись, что пипетка щелкает и правильно размещена.
Нажмите кнопку Пуск на сенсорном экране и подождите, пока не подадутся электрические импульсы. Медленно извлеките пипетку со станции и немедленно добавьте трансектированную клеточную суспензию в соответствующий колодец с предварительно нагретой средой, свободной от антибиотиков, медленно нажав кнопку до первой остановки. Аккуратно раскачайте пластину с трансективированными клетками и инкубируйте в течение одного-трех часов в инкубаторе культуры увлажненной ткани, затем добавьте 200 микролитров предварительно нагретой питательной среды в каждую лунку.
Поместите блюдо в инкубатор и подождите не менее 24 часов для экспрессии генов. На следующий день осмотрите жизнеспособность клеток и эффективность трансфекции с помощью эпифлуоресцентного микроскопа. Осторожно удалите среду из клеток с помощью микропипетки P-1000 и добавьте 500 микролитров стимулирующего раствора вниз по боковой стороне лунки.
Чтобы запустить необработанные контрольные скважины, добавьте среду визуализации без стимула. Чтобы визуализировать клетки с помощью эпифлуоресцентного или конфокального микроскопа, включите микроскоп и флуоресцентный источник света, следуя инструкциям. Выберите объектив 10 раз или 20 раз и поместите чашку культуры на ступень микроскопа.
Найдите ячейки под 568-нанометровым фильтром с помощью окуляра. И сосредоточьтесь на клетках, экспрессирующих репортерные красные клетки. Подсчитайте все красные клетки в поле зрения.
Находясь в том же поле зрения, перейдите на фильтры 488 или 512, подсчитайте количество красных ячеек, которые также являются зелеными. Подсчитайте не менее 100 красных ячеек минимум из трех полей. Рассчитайте процент Венеро-положительных трансективных клеток на поле зрения и усредните результирующие проценты для каждой скважины, чтобы получить стандартное отклонение.
Чтобы получить изображение клеток с помощью эпифлуоресцентного или конфокального микроскопа, визуализируйте живое изображение клеток на экране компьютера, полученное камерой. Тонкая настройка фокуса и положения ячеек с помощью джойстика управления и колеса фокусировки. Установите процент мощности лазера и время экспозиции для 512-нанометровых или 488-нанометровых и 568-нанометровых лазеров, чтобы сигнал на изображении выглядел хорошо без насыщения.
Включите захват в реальном времени и изучите полученное изображение, убедившись, что для каждого этажа в гистограммах дисплея для обоих каналов виден отдельный пик. При визуализации живого изображения клеток сделайте несколько репрезентативных изображений поля, содержащего одну или несколько ячеек, экспрессирующих репортер mCherry или dsRedmito для каждой лунки пластины. Отобранные CD-14 положительные моноциты, инкубированные с GM-CSF в течение семи дней, показали изменения в морфологии клеток в течение периода дифференцировки, переходя от сферических суспензионных клеток к веретенообразным и полностью присоединенным и, наконец, к более распространенным клеткам при полной дифференцировке.
Полностью дифференцированные клетки транссектировали с помощью каспазы BiFC-пар VC и VN вместе с репортерной плазмидой dsRedmito, которая использовалась для маркировки трансективных клеток. Необработанные клетки не показали флуоресценции Венеры. А в клетках, обработанных нигерицином, каспаза-1 BiFC появилась в виде одного пунктуума с типичной формой пятнышек ASC.
Количественное определение Venus-положительного MDM показало, что самый высокий процент caspase-1 BiFC наблюдается в группе лечения LPS плюс нигерицин. При плазмидном титровании пар каспазы-1, 4 и 5 про-BiFC самый высокий процент венерисоположительных клеток был получен из 400, 500 и 1000 нанограммов трансективной плазмиды соответственно. Конфокальные изображения, полученные с 20-кратным объективом поля клеток через 24 часа после трансекции, показали, что необработанные трансектированные клетки жизнеспособны, поскольку митохондрии неповреждены.
После лечения гемом комплекс каспазы-1 проявляется в виде одного зеленого пункта, аналогичного тому, который индуцируется нигерицином. Не забывайте избегать суровых условий и чрезмерных манипуляций с клетками во время дифференцировки, трансфекции и лечения, поскольку это может привести к спонтанной активации и высоким фоновым уровням активации каспазы.
