Текущий протокол способствует изучению механизмов мозга, лежащих в основе квалифицированного двигательного поведения. Беспроводная оптогенетика позволяет манипулировать конкретными нейронами, в то время как субъекты выполняют задачу в свободном движении. В сочетании с высокоскоростной видеосъемкой можно провести детальный анализ мелкомоторного поведения.
Метод может помочь понять двигательные проблемы при нейроразвитии и нейродегенеративных расстройствах. Эти методы могут быть использованы для изучения функции мозга и в других поведенческих парадигмах. Диана Родригес-Муньос, студентка моей лаборатории, будет помогать в эксперименте.
Для хирургических процедур начните с подготовки светодиодной канюли желаемой длины в соответствии с дорсо-вентральными координатами интересующей структуры. Для этого нарежьте стекловолокно на длину, превышающую конечный желаемый размер, и измельчите наконечник волокна до целевой длины грубой наждачной бумагой. Затем отполируйте наконечник волокна мелкой наждачной бумагой.
Для микроинъекций заполните пипетку минеральным маслом и поместите пипетку в микроинжектор. Убедитесь, что микроинжектор работает правильно, впрыскивая немного минерального масла. Далее подготовьте обезболенную мышь к операции, нанеся офтальмологическую мазь и удалив волосы с кожи головы триммером и кремом для удаления волос.
Затем протрите кожу головы ватными тампонами, содержащими 8% повидонового йода и 70% этанола, чередуемых по три раза каждый. После санитарной обработки поместите мышь в стереотаксический аппарат и закрепите голову, убедившись, что череп выровнен по медиально-латеральной и передне-задней осям. С помощью скальпеля сделайте сантиметровый разрез через кожу головы на уровне глаз вдоль сагиттальной оси.
Затем втяните кожу, чтобы обнажить череп и очистите надкостницу ватными тампонами. Очистите поверхность черепа физиологическим раствором и ватными тампонами и устраните любое кровотечение на поверхности с помощью стерильных абсорбирующих глазных копий. Затем нанесите каплю 2,5% перекиси водорода ватным тампоном и дайте ей действовать в течение нескольких секунд, чтобы швы черепа были видны и имели лучшую ссылку.
Через несколько секунд тщательно очистите область чистым ватным тампоном. С помощью стеклянной пипетки диаметром конечного наконечника 15 микрон найдите брегму и лямбду, чтобы убедиться, что череп выровнен в передне-задней оси. Затем нарисуйте маркером контрольную точку в скальпе над выбранными координатами.
В точке отсчета выполните трепанацию черепа диаметром в один миллиметр, оказывая мягкое давление на череп с помощью вращающегося инструмента на низкой и средней скорости с помощью небольшого круглого зубного сверла. После этого переместите капилляр к выбранным передне-задним, или AP, и медиально-латеральным, или ML, координатам. Загрузите капилляр от 300 до 400 нанолитров CreE-зависимого аденоассоциированного вируса, или AAV, такого как AAV1, D-flox channelrhodopsin mCherry для экспрессии канальногородопсина в интересующей области.
AAV может быть использован в качестве контроля для экспрессии репортерного белка. Убедившись, что наконечник не забит, вводят стеклянную пипетку в мозг по дорсо-вентральным минус 3,35 миллиметровым координатам в спинно-боковом полосатом теле и вводят 200 нанолитров вируса с помощью автоматического инжектора со скоростью 23 нанолитра в секунду. Подождите 10 минут после инъекции, прежде чем медленно снимать стеклянную пипетку, чтобы избежать разлива.
Затем очистите и высушите все остатки ватными тампонами. Затем прикрепите стеклянную светодиодную канюлю к стереотаксическому кронштейну и откалибруйте координаты, используя брегму в качестве эталона. Затем медленно вставьте канюлю, чтобы избежать повреждения тканей, и поместите ее на 100 микрометров выше места инъекции.
Как только светодиодная канюля будет на месте, добавьте каплю 100 микролитров тканевого клея на краю трепанации черепа. Используйте стерильную щетку, чтобы нанести свежеприготовленную зубную цементную смесь вокруг соединителя канюли понемногу, наращивая слои до тех пор, пока череп не будет покрыт, а соединитель надежно прикреплен к черепу, оставив штифты полностью свободными. Когда цемент полностью высохнет, закройте кожу вокруг имплантата с помощью тканевого клея.
Затем поместите мышь в клетку для восстановления над грелкой при температуре 33 градуса Цельсия, отслеживая признаки дискомфорта или боли. Записывайте поведение животного с помощью обычной камеры и захватывайте от 30 до 60 кадров в секунду с передней части камеры. Зеркало можно разместить под тренировочной камерой под углом 45 градусов для контроля осанки животного.
Когда мыши начнут достигать гранулы, поверните светодиодную канюлю вручную с помощью пульта дистанционного управления, чтобы иметь непрерывную стимуляцию в течение времени выполнения поведения в течение не более двух секунд. Стимулирующее устройство запускает светодиод 470 нанометров с интенсивностью на кончике одного милливатта на миллиметровый квадрат. Мелкомоторное поведение животного при оптогенетических манипуляциях изучали с задачей «дотянуть до захвата».
Мыши научились выполнять задание за пару дней и достигли более 55% точности, достигнув плато после пяти дней тренировок. Траектория движений отслеживалась с помощью высокоскоростной видеографии, что позволяло анализировать кинематику. Была проведена количественная оценка таких параметров, как пройденное расстояние, скорость, ускорение, конечная точка и траектория.
В пропущенных испытаниях мыши начинали хватательное движение дальше от гранулы, чем ударные испытания. Кроме того, ошибки были значительно связаны с осанкой мыши, о чем свидетельствуют различия в угле тела во время ударов и пропущенных испытаний. Контралатеральная активация D1 дофамина, экспрессирующего колючие проекционные нейроны, или SPN, уменьшала успех захвата по сравнению с контрольными условиями.
Во время оптогенетической стимуляции траектория лапы увеличивалась на расстоянии перемещения, что приводило к неспособности нацеливаться на гранулу и увеличению начальной погрешности первого типа. Анализ основных компонентов, или PCA, показал, что все траектории испытаний во время контралатеральной активации D1 SPNs разделены в кластере, почти не перекрывающемся с контрольным кластером, что указывает на низкое сходство. Активация DSPN в ипсилатеральной стороне привела к увеличению дисперсии траектории, показанной анализом PCA.
Следовательно, активация ipsilateral D1 SPNs изменила траекторию достижения без изменения поведенческого результата. При выполнении этого протокола будьте осторожны, чтобы правильно разместить канюлю, чтобы она не отсоединялась во время тренировок. Этот метод может быть использован в других поведенческих парадигмах для изучения моторного поведения, сенсорной обработки, обучения и памяти.
Беспроводная оптогенетика позволит изучать натуралистическое поведение и его нейробиологические основы у по-настоящему свободно движущихся субъектов.
