Внутри эмбрионов клетки взаимодействуют друг с другом, обмениваясь химической и механической информацией. Одним из эффективных способов зондирования этих взаимодействий является уничтожение некоторых клеток и мониторинг последствий для соседних клеток. Метод, который мы описываем, позволяет нам точно удалять клетки, даже внутри эмбриона, не повреждая соседние ткани.
Подготовьте двухфотонный микроскоп, установив первый лазер на длину волны абляции 820 нанометров, а второй лазер на длину волны изображения mCherry 1,160 нанометров. Используя подвижные зеркала на оптическом пути, выровняйте два лазерных луча на входе и выходе сканирующих головок, а затем измерьте максимальную мощность первого лазера на 820 нанометрах. Поместите измеритель мощности под объектив, закройте черную камеру и установите первую мощность лазера на 100% Начните сбор данных на измерителе мощности, откройте лазерный затвор, затем измерьте выходную мощность и вычислите процент мощности лазера, необходимый для достижения 300 милливатт.
Установите первый лазер на длину волны возбуждения GFP 920 нанометров и мощность на 7% Отрегулируйте мощность второго лазера до 15% Активируйте детекторы PMT для зеленых и красных линий и установите чувствительность PMT зеленой и красной линии на 65. Отрегулируйте поле зрения до 400 на 400 микрометров, разрешение изображения до 512 на 512 пикселей и частоту сканирования до 800 герц. Выберите режим 3D-покадровой визуализации, затем создайте папку и активируйте автосохранение для сохранения данных после каждого сбора.
Соберите нагревательную камеру и установите ее на 28 градусов по Цельсию. Подождите не менее 10 минут для камеры и целью согреться. С помощью флуоресцентного стереомикроскопа идентифицируйте эмбрионы с 70% эпиболией, которые экспрессируют GFP.
С помощью пластиковой пипетки Пастера переносят три-четыре отобранных эмбриона в блюдо, покрытое агарозой, и аккуратно дехорионируют их тонкими щипцами. В небольшой стеклянный флакон добавьте один миллилитр раствора пенициллин-стрептомициновой эмбриональной среды, содержащей 2% агарозы, и поместите флакон в предварительно нагретый, сухой блок-нагреватель при 42 градусах Цельсия. Используя отполированную огнем стеклянную пипетку, перенесите дехорионированный эмбрион во флакон, заботясь о том, чтобы не добавить слишком много эмбриональной среды к агарозе.
Выбросьте оставшуюся среду эмбриона из пипетки. Аспирируйте эмбрион обратно, вместе с достаточным количеством агарозы, чтобы покрыть слайд стеклянной нижней посуды. Выдуйте агарозу с эмбрионом на стеклянную горку тарелки, следя за тем, чтобы эмбрион не касался воздуха или пластиковой стороны тарелки.
Затем заполните камеру вокруг стеклянной горки агарозой. Используя ресницы, ориентируйте эмбрион так, чтобы целевая область находилась наверху. Через пять минут, когда агароза полностью застынет, добавьте несколько капель пенициллин-стрептомициновой эмбриональной среды в стеклянную горку.
Поместите стеклянную нижнюю посуду под объектив в нагретую камеру. Погрузить объектив в пенициллин-стрептомициновую эмбриональную среду перед закрытием камеры. Переместите ползунок, чтобы задать световой контур на окуляры.
Включите люминесцентную лампу. Найдите эмбрион и установите фокус на его поверхность. Выключите люминесцентную лампу и установите световой путь к PMT перед закрытием черной камеры.
Запустите визуализацию в реальном времени и найдите осевую мезодерму. Чтобы иметь хороший сигнал, отрегулируйте мощность лазера. Используйте красный канал, чтобы переместить стадию в самый верх эмбриона, и назначьте это положение, так как Z равно нулю.
Выберите шаг времени в одну минуту и Z-шаг в два микрометра. Установите первый срез на 15 микрометров выше осевой мезодермы, а последний срез на 15 микрометров ниже осевой мезодермы. Запишите от 10 до 15 минут фильма перед абляцией.
На динамическом изображении найдите контур полстера, затем, используя интересующую область электрооптического модулятора или инструмент EOM-ROI, нарисуйте прямоугольник размером 20 пикселей, который охватывает ширину полстера, и поместите прямоугольник в середину полстера. Обратите внимание на осевое положение самой высокой и самой низкой плоскостей, подлежащих удалению, гарантируя, что ROI to не перекрывает желтковую ячейку ни на одной из плоскостей. Поместите ступень в самое низкое Z-положение для удаления.
Установите длину волны первого лазера на 820 нанометров и введите процент мощности, рассчитанный ранее, чтобы получить выходную мощность 300 милливатт. Установите частоту визуализации на 200 герц, а первую лазерную визуализацию EOM на ноль. После выбора режима обработки ROI выключите EOM и настройте процедуру на запуск сразу после нулевого кадра.
Переведите режим обработки изображений в Timelapse и деактивируйте автосохранение. Выбрав Быстрый режим на шаге Время, настройте количество кадров обработки и количество кадров на значение, соответствующее заданной глубине. Запустите создание образа.
Комплектование должно быть черным, так как затвор пМТ закрывается во время обработки ЭОМ. Затем перейдите вверх по сцене в следующую Z-позицию и аналогично выполните абляцию. Повторяйте на каждом Z-положении до тех пор, пока не будет достигнута верхняя часть полстера.
Когда процесс абляции будет завершен, установите первый лазер на 920 нанометров и настройтесь на ранее выбранную мощность изображения. Поставьте первую лазерную визуализацию EOM на 100 и выберите режим полного поля. Частота изображения должна быть 800 герц, а EOM должен быть выключен перед изучением всего стека в режиме реального времени, чтобы проверить, была ли удалена каждая плоскость.
После подтверждения абляции выберите 3D Time lapse в качестве режима визуализации. Повторно активируйте автосохранение и начните запись фильма после абляции в течение 40–60 минут. В постабляционном фильме проверьте, были ли клетки-мишени эффективно абляции.
Поскольку абляция через полстеры не должна наносить вред эмбрионам, нормальная морфология абляционных эмбрионов может наблюдаться через 24 часа после оплодотворения. В успешном исходе лазерной абляции накладные ткани не были затронуты абляцией нижележащих структур. Слишком интенсивное лечение или слишком малое лечение приводило к сбоям в лазерной абляции.
Пример неудачной абляции показывает, что клетки над полстером аблятируются, что было видно по автофлуоресцентным обломкам в фокальной плоскости над полстером. В другой неэффективной попытке клетки были обесцвечены, но не абляции, а сигналы с низкой флуоресценцией все еще показывают неповрежденные контуры клеток. Наконец, некоторые клетки даже не были отбелены из-за недостаточной лазерной обработки.
Образование пузырьков происходит из-за кавитации, вызванной слишком интенсивным лазерным лечением. Z-стеки захватывались каждую минуту в течение 40 минут при успешной абляции, регистрируя как цитоплазматические сигналы GFP, так и ядерные сигналы mCherry. Кроме того, ядра, принадлежащие передней половине полстера, отмечены пурпурной точкой и отслеживаются с течением времени, до и после абляции.
В качестве меры стойкости миграции изучали направленную автокорреляцию клеток до и после абляции. Клетки, принадлежащие передней части полстера, демонстрировали стойкое движение перед абляцией, которое резко уменьшается после абляции, что указывает на потерю коллективно-ориентированной миграции. Правильное выравнивание лазеров и измерение мощности лазера имеют решающее значение для получения воспроизводимых результатов.
Также важно проверить эффективность абляции на первых изображениях после абляции. Мы используем лазерную абляцию, чтобы поставить под сомнение роль клеточных взаимодействий в управлении миграцией клеток внутри эмбриона. Но процедура может быть легко адаптирована ко многим другим вопросам, где клетки или ткани должны быть точно удалены, потенциально глубоко в организме.
