Этот протокол позволил ответить на важный вопрос в области метастазирования рака. В том числе, как опухолевые клетки колонизируют легкое? Как опухолевые клетки остаются в состоянии покоя?
А что побуждает их выходить из покоя и со временем образовывать метастазы. Основным преимуществом данного протокола является то, что динамический метастатический процесс можно непосредственно изучать in vivo, в режиме реального времени, в реальной микросреде. Этот метод может дать представление о нескольких легочных заболеваниях, но он особенно полезен для понимания поведения отдельных опухолевых клеток, распространяющихся в легкие, общее место метастазирования.
Для начала используйте шелковый шов 2-0, чтобы завязать узел у основания катетера 22 калибра, оставив хвосты длиной 2 дюйма. Как только мышь будет полностью обезболена, переместите мышь к операционному столу, интубируйте мышь, а затем закрепите катетер интубации, завязав шелковый шов 2-0 вокруг морды мыши. Подключите аппарат ИВЛ к интубационному катетеру.
С помощью бумажной ленты закрепите передние зубчатые и задние конечности каудально к нагретой хирургической стадии. Поместите бумажную ленту по всей длине спины мыши, чтобы максимизировать воздействие на операционное поле. Поднимите кожу щипцами и сделайте круговой разрез примерно на 10 мм примерно на 7 мм влево от грудины и примерно на 7 мм выше подреберного края.
Иссечь мягкие ткани, покрывающие ребра. Поднимите шестое и седьмое ребро с помощью щипцов. Используйте одно лезвие тупых микропарифицирующих ножниц с закругленной стороной по направлению к легкому, чтобы аккуратно проткнуть межреберную мышцу между шестым и седьмым ребрами для входа во внутригрудное пространство.
Деликатно разряжается канистра со сжатым воздухом при дефекте, чтобы разрушить легкое и отделить легкое от грудной стенки. Обжигайте сжатый воздух короткими очередями, чтобы предотвратить ятрогенное повреждение легких. Поместите биопсийный перфоратор на режущий инструмент и осторожно маневрируйте основанием режущего инструмента через межреберный разрез.
Ориентируйте основание режущего инструмента параллельно стенке грудной клетки и пробивайте круглое отверстие диаметром 5 мм через грудную клетку. Используя шелковый шов 5-O, поместите стежок из кошелька, примерно в 1 мм от отверстия, по окружности. Затем поместите оконную раму в грудную стенку с краями круглого дефекта, захваченного в паз окна.
Плотно завяжите шелковый шов 5-O, чтобы надежно зафиксировать имплантированное окно. Нанесите устойчивый и мягкий поток сжатого воздуха примерно на 10-20 секунд, чтобы высушить легкие. Используйте щипцы, чтобы захватить оконную раму за ее внешний край и осторожно поднять, чтобы обеспечить отделение легкого от нижней поверхности оконной рамы.
Распределите тонкий слой цианоакрилатного клея вдоль нижней поверхности оптической оконной рамы. Осторожно, но плотно надавите оптической оконной рамой на легочную ткань в течение 10-20 секунд для прикрепления. Нанесите каплю клея толщиной 5 мм на прямоугольную крышку.
Используйте вакуумный подборщик, чтобы подобрать 5-миллиметровый слип крышки. Опустите нижнюю поверхность крышки в клей, а затем соскоблите лишний клей три раза о сторону прямоугольного скольжения крышки, чтобы сделать очень тонкий слой клея на крышке. Осторожно расположите крышку под углом внутри углубления в центре оптической оконной рамы, чуть выше легочной ткани.
Кратковременно зажмите вентилятор, чтобы создать положительное давление, гиперраздувая легкое. Ориентируйте крышку параллельно легочной ткани, используя вращающееся движение для создания прямого осаждения между поверхностью легкого и нижней поверхностью скольжения крышки. Поддерживайте мягкое давление в течение примерно 25 секунд, чтобы установить цианоакрилатный клей.
Отделите крышку от вакуумного подборщика щипцами. Создайте стежок кошелька, по окружности, менее чем в 1 мм от разрезанного края разреза кожи, используя шелковый шов 5-O. Засуньте лишнюю кожу под внешний край оконной рамы, прежде чем плотно завязать окно запирающими узлами.
Распределите небольшое количество клея на границе раздела металлического стекла, чтобы обеспечить герметичное уплотнение между крышкой и оконной рамой. Прикрепите стерильную иглу к инсулиновому шприцу объемом 1 мл. Вводят иглу ниже мечевидного отростка, продвигаясь к левому плечу, проникая в грудную полость через диафрагму.
Осторожно отведите шприц назад, чтобы удалить остаточный воздух из грудной полости. Многофотонная прижизненная визуализация одной области легких показала, что микрососудистость может быть перемещена в течение трех последовательных дней. Определяемая точка ответвления от одного судна определялась каждый последующий день.
Немаркированные эритроциты создавали тени при протекании в более крупных сосудах. Угол точек ветвления относительно сосуда может быть использован для расчета скорости потока эритроцитов. Скорость эритроцитов также была количественно определена путем введения мышам флуоресцентных микросфер, и их длины треков были измерены, разделенные на время получения кадра.
Неподвижные и протекающие микросферы были различимы. Судьба диссеминированных опухолевых клеток отслеживалась с помощью серийной визуализации в течение нескольких дней, используя окно для визуализации легких с высоким разрешением. Опухолевая клетка прибыла и застряла в сосудистой системе легких в первый день.
Однако клетка не была обнаружена в сосудистой системе легких на второй и третий день, что указывает на рециркуляцию или экстравазацию. Кульминационные этапы метастатического прогрессирования в легком были визуализированы, начиная с прибытия опухолевой клетки, экстравазации опухолевой клетки в паренхиму легкого и пролиферации с образованием макрометастазов. Позаботьтесь о том, чтобы избежать травмы легкого во время установки оптической оконной рамы.
Легкое склонно к кровотечениям, которые впоследствии будут препятствовать скольжению покрова во время размещения. Другие методы, которые могут быть выполнены после этой процедуры, включают прижизненную микроскопию, которая при использовании с модифицированным подходом к микрокартографии позволяет точную релокализацию областей, представляющих интерес, для повторной визуализации. Этот протокол позволил визуализировать легкое при исследовании ключевого вопроса о механизме метастазирования.
Это исследование несет в себе потенциал для восстановления нового лечения больных раком.
