Изолевугландины были вовлечены в несколько заболеваний, особенно сердечно-сосудистых. Этот протокол был разработан для обнаружения изолевугландинов в тканях с белком слияния щелочной фосфатазы D11 и иммунофлуоресценции. Современные методы обнаружения являются дорогостоящими или требуют вторичного антитела для E-tag.
Найти надежное вторичное антитело сложно, но этот протокол устраняет стадию вторичного антитела. Погрузите слайды мышиных и человеческих тканей, залитых парафином, в ксилол три раза на пять минут, чтобы депаррафинизировать ткани. Для регидратации ткани промойте салфетки два раза 95% этанолом, затем два промывания 70% этанолом, а затем дважды 50% этанолом, приготовленным в воде.
Промойте предметные стекла в солевом растворе с трис-буфером с 0,1% Tween 20 три раза, заполнив держатель предметного стекла TBST. Затем выбросьте TBST. Поместите предметные стекла в предварительно нагретый буфер цитрата натрия и инкубируйте в скороварке, установленной на четыре минуты при высоком давлении, чтобы общее время извлечения антигена составило 20 минут.
По окончании инкубации снимите горки со скороварки и дайте им остыть в течение 20 минут при комнатной температуре. Трижды быстро промывайте слайды с помощью TBST, как показано на рисунке. Заблокируйте слайды, добавив 2% BSA, растворенного в TBST.
Накройте предметные стекла парафином и выдерживайте при комнатной температуре 15 минут. После инкубации выбросьте блокирующий буфер. Добавьте к предметным стеклам 200 микролитров щелочной фосфатазы D11, приготовленной в ТБСТ, и накройте предметные стекла парафиновой лентой.
После инкубации предметных стекол в увлажненной камере в течение трех часов при комнатной температуре трижды промойте предметные стекла ТБСТ. Проявите предметные стекла с помощью калориметрического проявителя щелочной фосфатазы для иммуногистохимии или флуоресцентного проявителя щелочной фосфатазы для иммунофлуоресценции. Промойте слайды один раз с помощью TBST, чтобы удалить излишки проявителя и предотвратить дальнейшее развитие цвета.
Покрасьте предметные стекла одним микрограммом на миллилитр HEX ядерным красителем, приготовленным в PBS для иммунофлуоресценции. Затем один раз промойте предметные стекла с помощью TBST, чтобы удалить лишнее пятно. Используйте монтажную среду, чтобы поместить защитное стекло на разработанные слайды.
Наблюдайте за предметными стеклами под микроскопом с инвертированным светом для иммуногистохимии или конфокальным флуоресцентным микроскопом для иммунофлуоресценции. Для подтверждения специфичности окрашивания D11 AP на изолевугландин можно провести четыре отрицательных контрольных эксперимента. В первом отрицательном контрольном эксперименте инкубируйте ткани с D11 AP, разбавленным в TBST или только TBST.
Затем инкубируют ткани с разбавленным D11 AP и бактериальным париплазматическим экстрактом, разведенным в TBST без линкера D11 AP. Для конкурентного анализа приготовьте изоЛГ и изоЛГ, аддутированные к сывороточному альбумину мыши, в молярном соотношении восемь к одному. Разбавьте D11 AP от одного до 10 в TBST.
Затем инкубируйте разбавленный D11 AP с 50 микрограммами на миллилитр MSA, приведенного изолевугландином, или неаддуктивного MSA в течение одного часа при комнатной температуре. Добавляйте D11 AP с изолевугландином MSA или D11 AP с неаддуктивной MSA в ткани для окрашивания. Используйте соответствующее вариабельное антитело D20 с одним фрагментом цепи для окрашивания тканей для окончательного отрицательного контрольного набора.
Иммунофлюоресценцию аорты у мышей с гипертонической и нормотензивной болезнью изучали с помощью этого протокола. Окрашивание D11 AP показало повышенную концентрацию изоЛГ в аорте мышей с ангиотензин-индуцированной гипертензией II по сравнению с контрольными мышами. D11 AP использовался для обнаружения изолевугландинов, присутствующих в тканях кишечника пациентов с гипертонией и нормотензивных людей.
В тканях больных артериальной гипертензией наблюдалась повышенная концентрация изолевугландинов. Ткани окрашивали париплазматическим экстрактом и без D11 AP. Более яркое окрашивание наблюдалось в ткани, окрашенной D11 AP, по сравнению с тканью, окрашенной париплазматическим экстрактом, что подтверждает, что окрашивание не было связано с неконъюгированной бактериальной щелочной фосфатазой, присутствующей в париплазматическом экстракте. В конкурентном анализе ткань, окрашенная D11 AP, предварительно инкубированная с конкурентом isoLG, показала уменьшенное окрашивание, аналогичное окрашиванию, наблюдаемому в тканях с D11 AP, которое показывает специфичность к D11 AP к изолевугландинам.
В отрицательном контроле окрашивание аорты мыши D11 AP приводило к сильному окрашиванию по сравнению с D20, что указывает на специфичность D11 AP к изолевугландинам в гипертонической аорте. Важно инактивировать любую эндогенную щелочную фосфатазу, присутствующую в ткани, чтобы ограничить фоновое окрашивание.
