Тест активации базофилов представляет собой дополнительный диагностический тест in vitro для оценки аллергических реакций, опосредованных IgE, которые оказались полезными для реакций, вызванных лекарствами, пищей или ингалянтами, а также при некоторых формах хронической крапивницы. Этот тест основан на определении базофильного ответа на аллерген или поперечно связывающую активацию IgE лекарственного средства путем измерения маркеров активации с помощью проточной цитометрии. Тест активации базофилов может быть полезным и дополнительным инструментом, позволяющим избежать контролируемых тестов для подтверждения диагноза аллергии, особенно у субъектов, испытывающих серьезные опасные для жизни реакции.
Кроме того, этот тест имеет преимущество в том, что он может анализировать реакцию против любого препарата или аллергена по сравнению с другими методами in vitro, которые доступны только для нескольких лекарств и аллергенов. Основные ограничения теста связаны с неоптимальной чувствительностью, особенно при лекарственной аллергии. Необходимость выполнения теста не дольше 24 часов после извлечения образца и отсутствие стандартизации между лабораториями и диагностическими алгоритмами.
Начните со сбора периферической крови в девяти миллилитровых гепаринизированных пробирках и поместите образцы в ротор, чтобы поддерживать их при комнатной температуре до тех пор, пока они не потребуются для экспериментального протокола. Пометьте две пять миллилитровых цитометрических пробирок каждая для отрицательного контроля и положительного контроля. Также пометьте по одной пробирке для различных испытуемых концентраций аллергена или лекарственного средства.
Затем поместите трубки в стойку так, чтобы трубки идеально подходили, не скользя. Для первого положительного контроля готовят четырехмикролярный раствор N-формилметионил-лейцил-фенилаланина или fMLP в 0,05% PBS-T для подтверждения качества базофилов. Для второго положительного контроля приготовьте 0,05 миллиграмма на миллилитр анти-IgE раствора с использованием PBS-T.
Приготовьте окрашивающую смесь, добавив по одному микролитру на 20 микролитров стимулирующего буфера. Затем добавьте 23 микролитра этой окрашивающей смеси в каждую трубку. Добавьте 100 микролитров PBS-T к отрицательным контрольным трубкам.
Добавьте 100 микролитров fMLP к одной из положительных контрольных трубок и добавьте 100 микролитров анти-IgE E к другой к остальным трубкам. Добавьте 100 микролитров различных концентраций аллергена или препарата и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут. После инкубации аккуратно добавьте 100 микролитров крови в каждую пробирку, чтобы избежать гемолиза.
Затем осторожно вихрьте трубки и высиживайте их в течение 25 минут при 37 градусах Цельсия в термостатической ванне со средним перемешиванием. Держите трубки при четырех градусах Цельсия не менее пяти минут, чтобы остановить дегрануляцию. К каждой трубке добавляют два миллилитра лизирующего буфера для лизирования эритроцитов.
Вращайте каждую трубку, а затем инкубируйте трубки в течение пяти минут при комнатной температуре. Центрифугируйте пробирки по 300 г при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Затем переверните стойку в раковину, чтобы декантировать супернатант, в то время как ячейки остаются на дне трубок.
Добавьте три миллилитра PBS-T в каждую трубку, чтобы промыть клетки и вихрь трубок. Выполните второй раунд центрифугирования, используя тот же набор параметров, и декантируйте супернатант, опрокидывая стойку в раковину. Затем держите образцы при четырех градусах Цельсия защищенными от света до проточной цитометрии.
Подключите проточный цитометр к программному обеспечению компьютера и подождите, пока цитометр не будет готов. Загрузите шаблон и настройки инструмента, как описано в текстовой рукописи. Начните процесс получения образца.
Чтобы отобрать активированные базофилы, сначала закройте лимфоциты с графика бокового рассеяния-прямого рассеяния. Затем загораживают базофилов из популяции лимфоцитов в виде клеток CCR3 + CD203c + и приобретают не менее 500 базофилов на трубку. Установите порог CD63 примерно на 2,5% с помощью отрицательных контрольных пробирок и проанализируйте образцы.
IgE-зависимые реакции гиперчувствительности исследовали путем проведения теста на активацию базофилов, или BAT, с использованием аллергенов и лекарств. Чувствительность базофилов анализировали путем измерения реактивности при многократно снижающихся концентрациях аллергена, которые помогают определить аллергическую концентрацию, которая индуцирует реакцию 50% базофилов или EC50. Во-первых, лимфоциты были закрыты от бокового диаграммы рассеяния вперед.
Затем базофилы были закрыты из популяции лимфоцитов в виде CCR3 + CD203c + клеток. Затем график CCR3-CD63 был использован для анализа активации базофилов с использованием CD63 в качестве маркера активации для двух препаратов и разных концентраций аллергена. Тест проводится со свежей цельной кровью и должен выполняться не дольше, чем через 24 часа после извлечения крови.
Стимул, используемый в тесте, не должен включать какие-либо вспомогательные вещества, и необходимо учитывать химические характеристики лекарств. Другие дополнительные методы in vitro для диагностики IgE-опосредованных аллергических реакций, или определение sIgE, или тест на высвобождение гистамина.
