Современные методы анализа ресничек трудоемки и подвержены ошибкам и смещениям. Наш подход направлен на оптимизацию времени и усилий при одновременном устранении потенциальных ошибок. Основным преимуществом, которое предлагает этот метод, является повышенная строгость и воспроизводимость и количественный анализ изображений.
Этот тип подхода не только относится к анализу ресничек, но и может быть широко применен ко многим биологическим вопросам клеток, включая те, которые касаются других органелл и цитоскелетных белков. Для начала откройте обучающий набор данных, выберите файл в меню, нажмите кнопку Импорт экспорта и выберите Создать ND-файл из последовательности файлов. Выберите папку, содержащую набор обучающих данных, и в центре диалогового окна откроется список файлов.
Вручную определите организацию файлов, используя хотя бы один параметр в раскрывающемся меню. Введите соответствующие числовые значения под каждым выбранным параметром и выберите «Нет» там, где параметры не выбраны. Нажмите кнопку Преобразовать, чтобы открыть документ ND.
Чтобы откалибровать изображение, щелкните правой кнопкой мыши на некалиброванной опции в левом нижнем углу изображения. Щелкните Откалибровать документ, затем щелкните Размер пикселя, введите значение и нажмите кнопку ОК. Выберите просмотр элементов управления анализом, откройте двоичную панель инструментов и выберите автоматическое обнаружение или рисование объекта для ручной идентификации ресничек путем точной трассировки отдельных цилиарных структур на всех открытых кадрах.
Для обучения ИИ выберите nis. ai, нажмите сегмент поезда. ai, чтобы открыть сегмент поезда.
ai box, а затем выберите исходный канал, который будет использоваться для обучения. Выберите соответствующие двоичные файлы GroundTruth для обучения ИИ. Выберите необходимое количество итераций для обучения ИИ в зависимости от двоичного размера и распределения, затем выберите папку назначения, чтобы сохранить обученный AI-файл, и нажмите «Обучить», чтобы обучить программное обеспечение. Этот процесс занимает несколько часов.
Откройте экспериментальные конфокальные изображения ресничек, как описано выше, преобразовав образец. Файлы TIF в файлы ND2. Во всплывающем окне выберите многоточечный из первого выпадающего меню и введите значение, соответствующее общему количеству изображений.
Во втором раскрывающемся списке выберите длина волны и измените значение на общее количество каналов в папке. Программа автоматически разблокирует окно выбора длины волны, расположенное в нижнем, правом конце всплывающего окна. В окне выбора длины волны используйте раскрывающееся меню цвета, чтобы выбрать цвет каждого канала.
Укажите каждому каналу другое имя в столбце name. Как только вся информация будет обновлена, нажмите кнопку Конвертировать. Откалибруйте изображения, как описано выше.
Убедитесь, что размер пикселя экспериментального набора данных соответствует размеру обучающего набора данных. Определите реснички на первом канале с помощью обученного ИИ из предыдущего шага. Открыть nis.
ai в меню выберите сегмент. ai, затем выберите AC3 в исходных каналах. Затем определите реснички на втором канале, выбрав MCHR1 в исходных каналах.
Программное обеспечение будет рисовать двоичные файлы на меченых ресничках. Затем проверьте изображения на наличие неправильно идентифицированных двоичных файлов. Выберите «Удалить объект» на двоичной панели инструментов, чтобы вручную удалить неправильно идентифицированные двоичные файлы.
После того, как реснички были идентифицированы и сегментированы, проанализируйте различные параметры ресничек, такие как длина и интенсивность, используя общий анализ трех инструментов. Выберите изображение в меню и нажмите новый рецепт GA3. Откроется новое окно с пустым пространством в центре.
GA3 автоматически обнаружит двоичные файлы, соответствующим образом помеченные в соответствии с ИИ, и включит соответствующий узел. GA3 также автоматически определяет каналы на изображениях и отображает их вкладки под каналами. ИИ будет сегментировать все реснички, подобные объектам в кадре, и обнаруживать неполные реснички по краям кадра.
Чтобы удалить их, выберите двоичную обработку, удалите объекты, а затем перетащите узел касания границ в пустое пространство и подключите узел к соответствующим двоичным файлам. Чтобы измерить длину ресничек, выберите размер объекта измерения, а затем длину. Перетащите параметр в центр и подключитесь к соответствующему двоичному узлу.
Чтобы измерить интенсивность ресничек, выберите некоторую интенсивность объекта. Перетащите параметр в центр и подключитесь к соответствующему двоичному узлу и интересующему каналу. В меню измерений перейдите к ратиометрии объектов и выберите коэффициент Мандера, чтобы настроить путь колокализации в GA3 путем измерения перекрытия двух каналов в отдельных ресничках.
Перетащите узел коэффициента Мандера в пустое пространство и подключите его к соответствующему двоичному файлу и каналам. ApУкажите измерения и единую таблицу, открыв меню управления данными. В базовой категории выберите столбец ApEn и нажмите кнопку Выполнить сейчас, чтобы измерить реснички.
Все измерения будут отображаться в одной выходной таблице. Репрезентативные изображения показывают, что обученный ИИ правильно идентифицировал реснички in vitro на изображениях клеток IMCD, первичных гипоталамических культур и культур гиппокампа, но никаких других нецилиарных структур, таких как цитокинетические мосты. Длина ресничек варьировалась от 0,5 до 4,5 микрометров в клетках IMCD и от двух до 12 микрометров в культуре гипоталамуса и гиппокампа.
ИИ измерил длину меченых AC3 ресничек in vivo на изображениях нашего дугообразного ядра, паравентрикулярного ядра и областей cornu ammonis one. Согласно анализу, гипоталамические реснички in vivo варьировались от одного до 15 микрометров, как видно на белых и коричневых полосах. В то время как реснички и область cornu ammonis варьировались от одного до 10 микрометров, как видно на серых полосах.
Интересно, что интенсивность цилиарного MCHR1 была сильнее в паравентрикулярном ядре, чем в дугообразном ядре. Интенсивность MCHR1 по сравнению с AC3 была построена для измерения их перекрытия. Большинство ресничек были положительными для обоих маркеров, в то время как некоторые реснички были положительными для AC3 или MCHR1.
Для количественной оценки колокализации MTHR1 в AC3 был измерен коэффициент перекрытия Мандера, и было отмечено значительное увеличение перекрытия в паравентрикулярном ядре, чем в дугообразном ядре. Для измерения интенсивности по длине ресничек полярность ресничек была определена с использованием Centrin2-GFP в качестве базального маркера тела. Это позволило отличить основание ресничек от кончиков вишневых положительных ресничек ARL13B-M.
Изменения интенсивности ARL13B по длине ресничек наблюдались там, где интенсивность ARL13B была выше у основания, чем на кончике реснички в дугообразном ядре, видимом слева, а также PVN, как видно справа. При анализе данных с помощью этого подхода важно убедиться, что качество и разрешение экспериментального набора данных соответствует тому, что используется для обучения ИИ. Основная полезность этого подхода заключается в том, что после обнаружения ресничек С помощью ИИ пользователь может творчески подходить к тому, какие свойства анализируются, настраивая рабочий процесс анализа, интегрированный в программное обеспечение.
