Общая цель этой процедуры – проследить в режиме реального времени за образованием проплатлета из мышиных мегакариоцитов, которые созрели в родной среде. Преимущество этого метода заключается в том, что он прост, воспроизводим и быстр. Можно проанализировать множество мегакариоцитов и визуализировать образование проплацелет всего за шесть часов, вместо того, чтобы ждать первого дня культивации, как для мышиных мегакариоцитов in vitro.
Интересным применением этого метода является возможность изучения эффекта фармацевтического лечения или генетической мутации, в частности, на этапе расширения проплатлета. Здесь нет вмешательства в процесс дифференциации, как в случае с культурой in vitro. Это видео помогает обеспечить эти ключевые этапы промывки и разрезания костного мозга.
Также объясняется, как классифицировать морфологию и мегакариоциты, что действительно полезно для характеристики дефектов тромбофильной болезни. Для начала нагрейте буфер Тирода при 37 градусах Цельсия и включите нагревательную камеру микроскопа, чтобы довести температуру до 37 градусов по Цельсию. Подготовьте все необходимые инструменты, такие как таймер, инкубационные камеры, пять миллилитров 21 калибра шприцев, щипцы, лезвие бритвы, пипетки Пастера, стеклянные слайды и 15-миллилитровая центрифужная трубка.
Промыть костный мозг двумя миллилитрами буфера Тирода, введя иглу 21 калибра в отверстие бедренной кости со стороны колена и медленно нажмите на поршень, чтобы извлечь неповрежденный цилиндр костного мозга. Используйте трехминутную литровую пластиковую пипетку, чтобы аккуратно и аккуратно перенести неповрежденный костный мозг на стеклянную горку. Отрежьте концы костного мозга, которые, возможно, были сжаты во время промывки.
Затем вырежьте тонкие поперечные участки толщиной 0,5 миллиметра с помощью острого лезвия бритвы, чтобы избежать повреждения мегакариоцитов. Используя пластиковую пипетку, соберите 10 секций в одну миллилитровую трубку, содержащую буфер Тирода. Аккуратно перенесите секции в инкубационную камеру диаметром 13 миллиметров.
Аспирируйте буфер и отрегулируйте объем до 30 микролитров буфера Tyrode, дополненного 5% сывороткой мыши. Расположите секции на расстоянии. Запечатайте самоклеящуюся камеру с помощью скольжения крышки 22 на 55 миллиметров, наклоняя скольжение крышки, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.
Поместите камеру в нагревательную камеру при 37 градусах Цельсия. Запустите хронометр и запускайте эксперимент в течение шести часов при 37 градусах Цельсия, делайте видео для записи трансформации мегакариоцитов. Через 30 минут клетки костного мозга постепенно мигрируют на периферию экспланта, образуя монослой.
После одного часа инкубации мегакариоциты можно идентифицировать по их большим размерам и полилобуляционным ядрам. Количество мегакариоцитов увеличивается после трех часов инкубации, а некоторые имеют длительные расширения. Нарисуйте карту, чтобы локализовать каждую секцию в инкубационной камере.
Через час определите видимые мегакариоциты, которые представляют собой гигантские полилобулированные клетки на периферии каждого участка, и нарисуйте их положения на рисунке. Повторите эту процедуру через три и шесть часов. Мегакариоциты подсчитывают вручную и классифицируют по их морфологии через три и шесть часов после запечатывания инкубационной камеры.
Они классифицируются как маленькие, большие с толстым намерением и расширяющиеся. С помощью картографирования их эволюцию можно проследить с течением времени. Результаты выражаются в процентах от каждого класса в каждое время наблюдения.
Классически, половина мегакариоцитов, видимых на периферии, простирается через шесть часов для костного мозга диких мышей. За судьбой круглых мегакариоцитов последовал захват последовательных изображений с течением времени, чтобы изобразить, как они образуют проплацелеты. Важно помнить при попытке этой процедуры держать экспланты на уровне 37 градусов цельсия в течение всего эксперимента.
Другая температура может изменить результаты. Интересно, что протокол экспланта может быть использован после экспериментов с интровертной микроскопией. В конце концов, мегакариоциты в эксплантатах костного мозга будут естественно флуоресцентными, и их поведение можно легко исследовать.
Это дает возможность сочетать разное лечение на одних и тех же животных и таким образом уменьшать количество мышей. В заключение, метод экспланта является быстрым, простым и дает много информации о способности природных мегакариоцитов к внешним проплацетам. Полученные качественные и количественные результаты являются ключом к нашему пониманию тромбофильных заболеваний.
в физиологическом или патологическом контексте.
